Journal of Applied Microbiology 2000, 88. стр .170-175

Механизм антимикробного действия эфирного масла Melaleuca alternifolia (масло чайного дерева)

S.D. Cox ¹ , C.M. Mann ¹ , J.L. Markham ¹ , H.C. Bell ² , J.E. Gustafson ³ , J.R. Warmington ³ and S.G. Wyllie ³ .

¹ Центр биоструктурных и биомолекулярных исследований. Университет Западного Сиднея, Хоксбери, Новый Южный Уэльс,

² Австралийский научно-исследовательский институт масла чайного дерева. Лисмор. Новый Южный Уэльс,

³ GeneticaBiotechnologies, Бентли, Западная Австралия

7236/5/99: получено 14 мая 1999 года; доработано 16 августа 1999 года и принято 16 августа 1999

S.D. COX, CM, MANN, J.L. MARKHAM, H.C. BELL, J.E. GUSTAFSON, J.R. WARMINGTON AND S.G. WYLLIE. 2000. Эфирное масло Melaleucaalternifolia(чайное дерево) обладает широким спектром антимикробной активности. Механизм его действия в отношении грамотрицательных бактерий EscherichiacoliAG100, грамположительных бактерий StaphylucoccusaureusNCTC8325, а также дрожжевых грибков Candida Albicans исследовался с помощью нескольких методов. В данной статье сообщается, что воздействие на эти микроорганизмы масла чайного дерева в минимальной ингибирующей и минимальной бактерицидной/фунгицидной концентрации вызывает угнетение дыхания, а также увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны бактерий и плазматической мембраны дрожжей, подтверждаемое  поглощением йодидапропидия. У кишечной палочки и золотистого стафилококка масло чайного дерева также вызывало потерю ионов калия. Также наблюдались различия восприимчивости тестируемых организмов к маслу чайного дерева: они интерпретируются с точки зрения изменения скорости проникновения монотерпенов через клеточную стенку и структуры клеточной мембраны. Способность масла чайного дерева нарушать проницаемость барьера структур клеточных мембран с сопутствующей утратой хемиосмотического контроля является наиболее вероятной причиной его бактерицидного/ фунгицидного действия при минимальных ингибирующих уровнях.

ВВЕДЕНИЕ

Эфирное масло Melaleucaalternifolia, известное как масло чайного дерева, имеет долгую историю применения в качестве местного антисептика (Markham1999). В последнее время оно пользуется репутацией безопасного, естественного и эффективного антисептика. Это вызвало всплеск популярности этого масла и в настоящее время оно в качестве основного антимикробного вещества или естественного консерванта входит в состав многих фармацевтических и косметических продуктов наружного применения.

Химический состав масла чайного дерева хорошо изучен; оно содержит в основном циклические монотерпены (Brophyи др., 1989), из которых около 50% окисленных и около 50% углеводороды. Масло чайного дерева обладает широким спектром антимикробной активности (см. Markham1999 г. для обзора), которая в основном обусловлена терпинен-4-олом (Southwellи др. 1993; Carsonи Riley, 1995).

Как известно, множества разных эфирных масел обладают антимикробными свойствами и во многих случаях эта способность связана с наличием активных монотерпеновых компонентов (Knoblochи др. 1988; Beylier1979; Morrisи др. 1979). Некоторые исследования также показали, что монотерпены оказывают мембраноразрушающий эффект (обзор Sikkemaи др., 1995). Изучение клеток кишечной палочки после контакта с маслом чайного дерева с помощью электронной микроскопии показало потерю клеточного электроноплотного материала и коагуляцию цитоплазматических компонентов, хотя было очевидно, что эти эффекты вторичны и произошли уже после гибели клеток (Gustafsonи др. 1998). Это масло также стимулирует выведение ионов калия из клетки, а также угнетало дыхание во взвесях клеток кишечной палочки, что подтверждает его летальное действие путем цитоплазматического повреждения мембраны (Cox и др., 1998).

Ниже сообщаются результаты дальнейшего изучения антимикробной активности масла чайного дерева в отношении трех клинически важных микроорганизмов Е. coli, Staphylоcoccusaureusи Candida Albicans.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Масло чайного дерева

Во всех тестах применялось масло чайного дерева из партия 6081, предоставленное MainCamp, Ballina, Новый Южный Уэльс, Австралия.

Рост тестовых микроорганизмов

Использованные во всех анализах клетки два раза пересевались в ISO-сенситест бульон (Oxoid, Basingstoke, Великобритания) при исследовании  кишечной палочки штамма AG100, дериват К-12 (Geоrgeи Levi, 1983) или Staph. aureusNCTC8325, и в бульон с экстрактом солода (Oxoid) при опытах с C. AlbicansKEMН5 при 37 ° C.

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) и минимальные бактерицидные / фунгицидные концентрации (МБК).

Определение МИК/МБК выполнялось согласно описанию проводили, как описано у Gustafson и др. (1998), со следующими исключениями. В экспериментах с C. Albicansвместо бульона с экстрактом солода (Oxoid) использовался ISO-сенситест бульон (Oxoid), из разведенной/анализируемой смесибыл исключенТвин-80. Минимальная бактерицидная/фунгицидная концентрация определялись путем отбора проб по 100 мкл из каждой пробирки, в которых отсутствовал рост на нейтрализующем бульоне, содержащем 30 г/л триптон-соевого бульона (Oxoid), 30 г/л нейтрализованного гидролизата печени (Oxoid) и 10 г/л  лецитина (DefianceMillingCo., AcaciaRidge,, Квинсленд). После 10 мин инкубации при комнатной температуре в каждую пробирку добавлялось по 10 мл ISO-сенситест (или бульон с экстрактом солода в опытах с C. Albicans), и затем выполнялась инкубация при 37 ° С в течение 72 часов. Минимальная бактерицидная/фунгицидная концентрация определялась как минимальная концентрация масла чайного дерева, при которой отсутствовал рост микрофлоры.

Анализ жизнеспособности

            Ночная культура инокулировалась на ISO-сенситест бульон (бульона с экстрактом солода, используемый в экспериментах с C. Albicans). Культура выращивалась при 37 °С до экспоненциальной фазы (4-5 ч), один раз промывалась и ресуспендировалась в стерильные 100-мл конические колбы, содержащие по 20 мл суспензии клеток и заданный объем масла чайного дерева. Содержимое каждой колбы постоянно перемешивалось магнитной мешалкой для равномерного распределения масла по всему объему. Через заданные промежутки времени отбирались аликвоты (1 мл) в 9 мл нейтрализующего бульона и выдерживались при комнатной температуре 10 минут. Выполнялись 10-кратные последовательные разведения нейтрализующего бульона в 0,1% пептона, которые разливались в подготовленные чашкис триптон-соевым агаром (Oxoid). Колонии подсчитывались после 3-х дневной инкубации при 37 ° Cи количество жизнеспособных клеток сообщалось как число колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл.

Измерение дыхания

            Уровень микробного дыхания определялся с помощью кислородного электрода, согласно описанию Cox и др. (1998). В экспериментах с Е. coliи C. Albicansклеточные суспензии предварительно инкубировались в течение 5 минут при заданной концентрации масла чайного дерева, и затем измерялась дыхательная активность. В опытах с Staph. aureus, клетки в течение 10 минут предварительно инкубировались в присутствии масла чайного дерева,  и затем выполнялись измерения.

Отток ионов калия

Концентрация ионов калия в суспензиях клеток измерялась с помощью калиевого селективного электрода согласно описанию Cox и др. (1998). Общая концентрация свободного калия в суспензии Staph. aureusопределялась после инкубации в лизостафине (100 мкг/мл) при 37° С в течение 60 минут с последующей обработкой ультразвуком. Для измерения суммарного свободного калия в C. Albicans, клетки лизировались инкубацией в хитиназе (lмг/мл) и литиказе (lмг/мл) при 37° С в течение 60 минут, а затем обрабатывались ультразвуком. Полнота лизиса в каждом случае подтверждалась микроскопическим исследованием.

Поглощение йодида пропидия

            Клетки (100 мл культуры) выращивались в течение ночи согласно описанию выше, промывались и ресуспендировались в 50 ммоль/л натрий-фосфатном буфере, рН 7,1. Аликвоты (1 мл) помещались в конические колбы, содержащие 19 мл буфера и заданное количество масла чайного дерева. Плотность инокуляции составляла примерно 10 ⁸ КОЕ/мл. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре, аликвоты по 50 мкл переносились в пробирки Эппендорфа, содержащие 950 мкл фосфатного буфера в пробирках FACS(BectonDickinson, ImmunocytometrySystems, MountainView, Калифорния). Эти пробирки хранились на льду, и в них добавлялось по 5 мкл окрашивающего раствора, состоящего из 2-5 мг/мл йодида пропидия (Molec­ularProbes, Eugene, штат Орегон), растворенного в очищенной воде milliQ, до достижения конечной концентрации йодида пропидия 10 мкг/мл. Сразу же после этого определялась процентная доля клеток, окрашенных йодидом пропидия, с помощью FAC-Scanпроточного цитометра (BectonDickinson).

Анализ выведения карбоксифлуоресцеина под влиянием масла чайного дерева

            По процедуре New(1990) готовились многослойные липидные везикулы. Фосфолипиды (14 мг фосфатидилэтаноламина, 4 мг фосфатидилглицерина и 2 мг кардиолипина) растворяли в хлороформе в круглодонной колбе на 100 мл и выпаривали досуха. После этого сухую смесь фосфолипидов ресуспендировали в 2 мл 50 ммоль/л натрий-фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего самогасящуюся концентрацию карбоксифлуоресцеин (100 ммоль/л), с легким встряхиванием со стеклянными шариками. Полученную суспензию липосом (многослойных липидных везикул) затем диализовали на протяжении ночи для удаления неинкапсулированного карбоксифлуоресцеина. Суспензию липосом (100 мкл) вливали в пробирку Эппендорфа, и затем добавляли фосфатный буфер и заданное количество масла чайного дерева до достижения конечного объема 1 мл. После этого смесь перемешивали вихревой мешалкой и инкубировали на протяжении заданного интервала времени с периодическим перемешиванием каждые 5 минут. По окончанию инкубационного периода 50 мкл липосомной суспензии отбирали в 2 мл фосфатного буфера. Флуоресценцию измеряли в стеклянной кювете флуоресцентным спектрофотометром (HitachiF-4500, Hitachi, Сан-Хосе, Калифорния, США, λ _ех = 470 нм;. λ _{е m} = 520 нм).  Стопроцентная утечка карбоксифлуоресцеина определялась путем добавления тритона X-100 1,0об.%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) и минимальные бактерицидные/фунгицидные концентрации (МБК) масла чайного дерева

            Для кишечной палочки штамма AG100 и Staph. aureusNCTC8325 значения МИК и MБК масла чайного дерева составляли соответственно 0,25об.% и 0,5об.%. Значения МИК и MБК для C. AlbicansKEM115 были в два раза ниже – соответственно, 0,125об.% и 0,25об.%.

Влияние масла чайного дерева на жизнеспособность клеток

            Влияние масла чайного дерева на жизнеспособность кишечной палочки, золотистого стафилококка и С. Albicansпоказано на рис. 1 (а, б, в). Каждый график отображает результаты трех отдельных экспериментов, показавших сходные результаты. К минимальной ингибирующей и минимальной бактерицидной концентрации масла чайного дерева наиболее чувствительной оказалась кишечная палочка, затем С. Albicansи, наконец, золотистый стафилококк.

Рис. 1. Влияние масла чайного дерева на жизнеспособность тестовых микроорганизмов:

(а) кишечная палочка AG 100: (О) без масла чайного дерева; (■) 0,50 об.% масла чайного дерева.

(b) золотистый стафилококк NCTC 100: (О) без масла чайного дерева; (•) 0,25% об% масла чайного дерева; (■) 0,50 об.% масла чайного дерева.

(с) C. Albicans KEM Н6:100: (О) без масла чайного дерева; (●) 0,125 об.% масла чайного дерева; (□) 0,25 об.% масла чайного дерева; (■) 0,50 об.% масла чайного дерева.

Влияние масла чайного дерева на дыхание

            Масло чайного дерева угнетало дыхание в суспензии клеток кишечной палочки, золотистого стафилококка и C. Albicans(рис. 2). Угнетение дыхания Е. coliначиналось при 0,25 об.% масла чайного дерева и дыхание полностью останавливалось при 0,5об.%. Дыхание клеток С. Albicansугнеталось при 0,125об.%, которая являлась минимальной анализируемой концентрацией, соответствующей MИК этого микроорганизма. Ингибирование клеточного дыхания Staph. aureus(после 10 минут воздействия масла чайного дерева), начиналось при концентрации 0,5об.%.

Влияние масла чайного дерева на целостность мембраны

            После 30-минутной экспозиции 0,25 об.% масла чайного дерева клеточных суспензий кишечной палочки, золотистого стафилококка и C. Albicansимело место увеличение клеточной проницаемости для йодида пропидия и флуоресцентно-окрашенной нуклеиновой кислоты (рис. 3), по сравнению с контрольной взвесью без масла чайного дерева. Отсутствие проникновения йодида пропидия через интактную цитоплазматическую или плазматическую мембрану (см. Brulи др. 1997; Masonи др. 1997; Wenischи др. 1997; Lebaronи др.1998) подтверждалась низким уровнем поглощения, наблюдавшимся в клетках, не подвергавшихся воздействию масла чайного дерева (рис. 3).

Масло чайного дерева в концентрации 0,25 об.% вызывало выведение ионов калия из клеток кишечной палочки и золотистого стафилококка (рис. 4). Данные трех отдельных, показавших сходные результаты, экспериментов свидетельствуют, что утечка из клеток E.coli начиналась сразу же после добавления масла чайного дерева и примерно через 30 мин достигала 100% суммарного запаса клеточного калия. Выведение ионов калия из клеток золотистого стафилококка начиналось примерно через 5 минут воздействия масла чайного дерева и продолжалось более медленными темпами, достигая после 30 мин 20%. Утечка ионов калия из клеток C. Albicans в присутствии 0,25об.% масла чайного дерева в течение двух часов не превышала фонового уровня (данные не представлены). Тем не менее, после 60-минутного контакта с 2,5 об.% масла чайного дерева количество калия в надосадочных жидкостях клеток составляло 23,1% от такового в надосадочных жидкостях общих клеточных лизатов.

Масло чайного дерева (0,25 об.%) также стимулировало выведение инкапсулированного карбоксифлуоресцеина из суспензии многослойных липидных везикул (рис. 5).

Рис. 2 Воздействие концентрации масла чайного дерева на скорость потребления О ₂ в суспензии клеток кишечной палочки AG 100 (O), золотистого стафилококка NCTC 8325 (●) и C. Albicans KEM Н5 (□). Величина ошибки представлена стандартными отклонениями (n = 3) по данным двух экспериментов. В некоторых случаях величина погрешности была столь малой, что отображающий ее столбик перекрывался символом данных.

Рис. 3 Поглощение йодида пропидия в суспензии клеток кишечной палочки AG100, золотистого стафилококка NCTC 8325 и C. Albicans KEM H5. Клетки подвергались воздействию 0,25об.% масла чайного дерева в течение 30 мин (□) и сравнивались с контрольной колбой без масла чайного дерева (■). Величина ошибки представлена стандартными отклонениями, рассчитанными по данным отдельных анализов (n = 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании масло чайного дерева в минимальной ингибирующей концентрации угнетало дыхание клеток кишечной палочки, золотистого стафилококка и C. Albicans. Не исключено, что масло чайного дерева напрямую ингибирует дыхательные ферменты или обменные процессы. Вместе с тем, полученные результаты показывают, что минимальные ингибирующие уровни масла чайного дерева также изменяют структуру клеточной мембраны. Наблюдалось повышенное поглощение нуклеиновой кислоты, окрашенной йодидом пропидия, для которого клеточные мембраны, как правило, непроницаемы. Кроме того, происходила утечка ионов калия, которая в суспензии клеток E.coli начиналась сразу же после добавления масла чайного дерева, а в суспензии клеток золотистого стафилококка в течение 5 минут.

Рис. 4 Действие 0,25 об.% масла чайного дерева на отток ионов калия в клеточных суспензиях кишечной палочки AG 100 и золотистого стафилококка NCTC 8325. (O): Е. coli 0,50% об% масла чайного дерева, (●):Е. coli, без масла чайного дерева. (□): Staph. aureus, 0,25% об% масла чайного дерева, (■):Staph. aureus без масла чайного дерева.

В экспериментах с C. Albicans не было обнаружено появления ионов калия в надосадочной жидкости клеток, содержащих 0,25 об.% масла чайного дерева. Тем не менее, окрашивание клеток С. Albicans йодидом пропидия после добавления масла чайного дерева является явным признаком повреждения плазматической мембраны. Возможно, что ионы калия не появляются в надосадочной жидкости (после воздействия на протяжении до 2 ч) потому, что они по-прежнему остаются заключенными в толстом слое клеточной стенки Candida Albicans. Учитывая повышенную проницаемость для йодида пропидия, представляется маловероятным, чтобы плазматическая мембрана оставалась непроницаемой для ионов калия. Дополнительным подтверждением общей токсичности масла чайного дерева в отношении мембранных структур является его влияние на проницаемость многослойных липосом.

Ранее мы показали, что масло чайного дерева в минимальной ингибирующей концентрации угнетает дыхание и вызывает утечку клеточного калия в клетках E.coli (Cox и др., 1998). Эти явления, а также выводы, представленные здесь, показывают, что масло чайного дерева повреждает структуру клеточных мембран кишечной палочки, золотистого стафилококка и C. Albicans. Цитоплазматические мембраны бактерий, плазматическая и митохондриальная мембраны дрожжей обеспечивают барьер для малых ионов, в частности H ⁺ , K ⁺ , Na ⁺ и Ca ²⁺ и позволяют клеткам и органеллам контролировать поступление и отток из клеток различных соединений. Эта роль барьера проницаемости клеточных мембран является неотъемлемой частью многих клеточных функций, в частности сохранение энергетического состояния клетки, других мембраносвязанных процессов энергообмена, транспорта солей, регуляции обмена веществ и регулирования давления тургора (Booth 1985; Poolman и др. 1987; Trumpower и Gennis 1994).

Рис. 5 Утечка карбоксифлуоресцеина из многослойных липидных везикул под влиянием масла чайного дерева. (О): без масла чайного дерева; (●): 0,25об.% масла чайного дерева. Величина ошибки представлена стандартными отклонениями (n = 2).

Антимикробное действие эфирных масел и их монотерпеноидных компонентов обычно объясняют токсическим действием на мембранные структуры и функции (Andrews и др. 1980; Uribe и др. 1985; Knobloch и др. 1988). Sikkema и др. (1994) показали, что циклические монотерпены за счет присущих им липофильных характеристик частично переходят из водной фазы в мембранные структуры. В результате происходит расширение мембран, увеличение проницаемости мембран и ингибирование мембранных ферментов. В клетках дрожжей и изолированных митохондриях, α- и β-пинены повреждают целостность клеток, угнетают дыхание и тормозят процессы переноса ионов, а также повышают проницаемость мембран (Andrews и др. 1980; Uribe и др. 1985). Недавно, Helander и др. (1998) описали влияние различных эфирных компонентов на проницаемость внешней мембраны грам-отрицательных бактерий. Тот факт, что вызванное маслом чайного дерева повреждение клеточной структуры мембран сопровождалось снижением жизнеспособности всех трех исследуемых микроорганизмов, заставляет предположить описанное Helander явление, как наиболее вероятную причину гибели клеток.

Несмотря на сходные значения МИК/МБК, исследуемые здесь микроорганизмы продемонстрировали явные отличия восприимчивости к маслу чайного дерева. Темпы снижения жизнеспособности С. Albicans в 0,25об.% масла чайного дерева были меньше, чем у кишечной палочки при воздействии той же концентрации; скорость инактивации золотистого стафилококка была медленнее, чем у кишечной палочки или C. Albicans. Относительное подавление дыхания и степень повреждения мембран этих микроорганизмов демонстрировали аналогичные тенденции. Учитывая широкий спектр антимикробной активности масла чайного дерева и общий мембрано-повреждающий эффект, вполне вероятно, что наблюдаемые отличия отражают скорость проникновения активных компонентов масла через клеточную стенку и в фосфолипидные участки клеточных мембранных структур.

Подведем итог: наши наблюдения подтвердили, что антимикробная активность масла чайного дерева объясняется его способностью нарушать проницаемость барьера мембранных структур микроорганизмов. Этот механизм действия одинаков в отношении клеток кишечной палочки, золотистого стафилококка и C. Albicans, и сходен с другими мембрано-активными дезинфицирующими средствами и консервантами широкого спектра действия, например, производными фенола, хлоргексидина (см. McDonnell и Rus­sell 1999) и парабензойной кислоты (Sox 1997).

БЛАГОДАРНОСТЬ

Эта работа полностью профинансирована исследовательским институтом масла австралийского чайного дерева (ATTORI), Лисмор, Новый Южный Уэльс, Австралия.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Andrews, R.E., Parks, L.W. and Spcnce, K.D. (1980) Some effects of Douglas fir tcrpenes on certain microorganisms. Applied and Environmental Microbiology 40, 301-30A

Beylier, M. (1979) Bacteriostatic activity of some Australian essential oils. Perfumer and Fhivimrtst 4, 23-25.

Booth, LR. (1985) Regulation of cytoplasmic pH in bacteria Micro­biological Reviews 49, 359-378.

Brophy, J.J., Davies, N.W., Southwell, LA., Stiff, LA. and Williams, L.R. (198**) Gas chromatographic quality control for oil of Mel­aleuca tcrpincn-4-ul type (Australian tea tret) Journal of Agri­cultural ami Food Chemistry 37, 1330- 1335.

Brul, S., Nusshaum, J. and Dielbandhoesing, S.K. (1997) Flu­orescent probes for wall porosity and membrane integrity in filamentous fungi. Journal of Microbiological Methods 28, 169 178.

Carson, C.F. and Riley, T.V. (1995) Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Journal of Applied Btict-eriahgy 78, 264-269.

Cox, S.D., Gusrufson, J.K., Mann, CM., Markham, J.I,., Liew, Y.C., Ilarlland, R.P., Bell, H.C., Warmingtun, J.R. and Wyllie, S.G. (1998) Tea tree oil causes K4 leakage and inhibits respiration in Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology 26, 355- 358.

George, A.M. and Levy, S.B. (1983) Amplifiablc resistance to tetra­cycline, chloramphenicol, and other antibiotics in Escherichia coli: involvement of a non-plasm id-determined efflux of tetracycline, Journal af Bacteriology 155, 531-540.

Gustafson, J.E., Liew, Y.C., Chew, S., Markham, J.L., Bell, H.C., Wyllie, S.G. and Warmington, J.R. (1998) Effects of tea iree oil on Escherichia colt. Letters in Applied Microbiology 26, 194—198.

Helander, I.M., Alakomi, H.-L., Kyosti, 1..-K., Mattila-Sandhulm, T., Pol, I., Smid, K.J., Gorris, G.M. and von VVrighi, A. (1998) Characterization of the action of selected essential oil components on Gram-negative bacteria. Journal of Agricultural Food Chemistry 46, 3590-3595.

Knobloch, K., Pauli, A,, Iberl, B., Wets, N. and Weigand, H. (1988) Antibacterial activity and antifungal properties of essential oil components. Journal of Essential Oils Research 1, 119-128.

Lebaron, P., Catala, P. and Parthuisot, N. (1998) Effectiveness of SYTOX Green stain for bacterial viability assessment. Applied and Environmental Microbiology 64, 2697-2700.

Markham, J. I.. (1999) Biological activity of tea tree oil. In Tea Tree, the Genus Melaleuca, ed. Southwell, I. and Lowe, R., pp. 169-190. Amsterdam: Harwood Academic Publishers.

Mason, D.J.. Dybowski, R., Earriek, J.W. and Gant, V.A. (1997) Antimicrobial action of rabbit leukocyte CAI'181(1(, n7. Antimicro­bial Agents and Chemotherapy 41, 624-629

McDonnell, G. and Russell, A.D. (1999) Antiseptics and dis­infectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews 12, 147-179.

Morris, J.A., Khettry, A. and Scitz, E.W. (1979) Antimicrobial activity of aroma chemicals and essential oils. Journal of the Amer­ican Chemical Society 56, 595-603.

New, R.R.C. (1990) Characterization of liposomes. In Liposomes; A Practical Approach, cd. New, R.C.C., pp. 105-162. Oxford: IRI. Press.

Poolman, B., Driessen, A.J.M. and Konings, W.N. (1987) Regu­lation of solute transport in Streptococci by external and internal pH values. Microbiological Reviews 51, 498-508.

Sikkema, J., de Bunt, J. A.M. and Poolman, B. (1994) Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. Journal of Biological Chemistry 269, 8022 8028.

Sikkema, J., de Bunt, J.A.M. and Poolman, B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiological Reviews 59, 201-222.

Southwell, I.A., Hayes, A.J., Markham, J.I., and Leach, D.N. (1993) The search for optimally bioactive Australian tea tree oil. Acta Horheulturac 334, 265-275.

Sox, T.E. (1997) Mechanisms ofacrion of cosmetic preservatives. In Cosmetic Microbiology: a Practical Handbook-, ed. Brannan, D.K. pp. 163 176, Boca Raton, FL: CRC Press.

Trumpower, B.E. and Gennis, R.B. (1994) Energy transduction by cytochrome complexes in mitochondrial and bacterial respiration: the enzymology of coupling electron transfer reactions to trans­membrane proton translocation. Inmial Reviews in Biochemistry 63, 675-716.

Uribe, S., Ramirez, T. and Pena, A. (1985) Effects of/f-pinene on yeast membrane functions. Journal of Bacteriology 161, 1195-1200.

Wenisch, C, Linnau, K.F., Parschalk, B., Zedtwitz-Lebenstein, K. and Georgopotous, A. (1997) Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Micro­biology 35, 5-10.

Влияние происхождения сырья на безопасность и эффективность масла чайного дерева (Melaleuca alternifolia)

C. F. Carson¹ иT.V. Riley^1,2

¹ Отделение микробиологии медицинского центра им. королевы Елизаветы II университета Западной Австралии, Недландс, WA 6009, Астралия

² Отделение микробиологии и инфекционных болезней Западно-австралийского центра патологии и медицинских исследований, Локед-Бэг 2009, Недландс, WA 6009, Австралия

Обсуждаются идентичность, источники сырья и состав масла чайного дерева (Melaleuca alternifolia), а также указаны ошибки, встречающиеся в ранних литературных источниках. Приведен обзор отчетов о терапевтических и аллергических эффектах.

Ключевые слова: масло чайного дерева, Melaleuca alternifolia; масло мелалеуки, химический состав, контактная аллергия, антимикробные, медикаменты. © Munksgaard, 2001.

Принято к публикации 29 января 2001

В последней публикации этого журнала (1) после сообщения о небольшом количестве отчетов о контактном дерматите в связи с эвкалиптолом описан случай контактного дерматита, вызванного эвкалиптолом, полученного из Malaleuca alternifolia (2). На основании этого может сложиться впечатление, что весь эвкалиптол экстрагируют из Melaleuca alternifolia. Вместе с тем, эвкалиптол, известный как 1,8-цинеол, является основным компонентом эвкалиптового масла, получаемого отжимом из различных видов эвкалипта, в частности Eucalyptus globulus иE. polybractea, а M. alternifolia – это основное сырье для промышленного изготовления эфирного масла, называемого маслом чайного дерева. Хотя оба рода Eucalyptus и Melaleuca принадлежат к семейству Myrtaceae, состав получаемых из них масел кардинально отличается.

            Описывающая 4 случая аллергии на масло чайного дерева статья Van der Valk с соавторами (2) внесла еще больше путаницы относительно эвкалиптола и масла чайного дерева. Упоминаемое в этой статье масло чайного дерева, полученное якобы из M. alternifolia, почему-то описывается как содержащее эвкалиптол. В обеих этих статьях и в еще одно раннем отчете об одном случае аллергии в качестве основных компонентов масла чайного дерева указаны a-пинен, b-пинен, п-цимен, эвкалиптол, линалоол, терпинеол и b-кариофиллен. Если в этих работах исследовалось масло такого состава, то оно не имело ничего общего с маслом чайного дерева, выделяемого из M. Alternifolia, и не соответствует требованиям международного стандарта по составу масла чайного дерева (4).

            Эти несоответствия обуславливают определенную путаницу относительно идентичности, источников сырья и состава масла чайного дерева. Приведем и другие, недавно появившиеся в литературе заблуждения, в частности, что масло чайного дерева должно содержать не менее 30% терпинена (5), что M. alternifolia произрастает в Испании, Португалии, Калифорнии и островах Океании  (3, 6), что «каепутовое масло» - это синоним масла чайного дерева (7), о существовании перекрестной сенсибилизации или перекрестной реакция на колофоний (6, 8, 9), а также что основным аллергеном является эвкалиптол (2).

            Вместе с тем, начиная с 1996 года состав масла чайного дерева регламентируется международным стандартом масла чайного дерева "Oil of Melaleuca - terpinen-4-oltype (tea tree oil)'' [масло мелалеуки, терпинен-4-ол типа (масло чайного дерева)] (4). В основу этого стандарта был положен стандарт Австралии (10) и, заметим, нигде в этих стандартах не сказано, из каких видов растений должно производиться это масло. Стандарт Австралии регламентировал содержание в составе масла чайного дерева 1,8-цинеола не более 15% и терпинен-4-ола не менее 30%. Заменивший этот документ международный стандарт является более полным, и устанавливает требования по граничному содержанию 14 из примерно 100 компонентов (таблица 1). Международный стандарт регламентирует содержание терпинен-4-ола в масле более 30% (4), хотя на практике содержание этого соединения в масле редко когда ниже 40%.

Таблица 1. Требования к составу масла чайного дерева^a)

^a)  По материалам источника (4).

Масло чайного дерева производят главным образом из M. alternifolia, выращиваемого на промышленных плантациях в штатах Новый Южный Уэльс и Квинсленд в Австралии. До начала промышленного выращивания природный ареал M. alternifolia ограничивался местностью вокруг рек Кларенс и Ричмонд на северо-восточном побережье Нового Южного Уэльса. Соответствующее международному стандарту масло можно получать и из других видов Melaleuca, в частности из M. dissitiflora и M. linariifolia (12). Кроме того, не исключено существование и других видов, из которых можно получать соответствующее стандарту масло.

            В некоторых случаях установить ботаническое происхождение эфирного масла затрудняет широкое распространение общеупотребительных названий, которые не позволяют точно определить происхождение растительного сырья. Так, используется ряд исторических названий масла чайного дерева, в частности «масло мелалеуки» и «чайное масло». Широко применяемое в Маори и Самоа название «чайное масло» относится к маслу из растений рода Cordyline (13). Использование же термина «масло мелалеуки» вообще вводит в заблуждение, поскольку в некоторых случаях подразумевается масло абсолютно иного химического состава, получаемого из других видов Melaleuca, например, каепутовое масло (также «каепут» или «каюпут») из растений M. Cajuputi, или масло найоли из M. quinquenervia (которое часто путают с M. viridiflora) (14). На данный момент Австралийская администрация лекарственных средств в качестве официального названия утвердила термин «масло мелалеуки».

            Еще больше этот вопрос усложняет использование общеупотребительных названий растений. В Австралии «чайное дерево», также известное как «бумажнокорое дерево», является обобщающим названием нескольких сот видов растений рода Melaleuca и Leptospermum. Например, M. cajuputi часто называют «болотное чайное дерево» и «чайное дерево с бумажной корой», а M. quinquenervia – «широколиственное чайное дерево» или «широколистное бумажнокорое дерево» (14). Окультурено множество видов Leptospermum, и многие из них часто ошибочно считаются сырьем получения масла чайного дерева. Также следует отметить, что т.н. новозеландское масло чайного дерева, получаемое из произрастающих в Новой Зеландии растений Kunzea ericoides и Leptospermum scoparium (называемое еще эфирным маслом, соответственно кануки или мануки), не имеет ничего общего с собственно маслом чайного дерева, поскольку имеет абсолютно другой состав (15).

            В литературе опубликован ряд отчетов о положительных кожных аллергических пробах на масло чайного дерева (2, 3, 6-8, 16, 17). Однако сообщенный в двух отчетах состав исследуемого масла (2, 3) не соответствовал требованиям международного стандарта или действовавшего ранее австралийского стандарта. В другом отчете (7) трудно идентифицировать исследуемое масло, поскольку часто в качестве синонима использовался термин «каепут», а данные о составе не приведены. Также под большим вопросом предположение о перекрестной сенсибилизации масла чайного дерева и колофония. Так, в исходном отчете описания случая (6) вообще не было указаний на перекрестную реакцию или перекрестную сенсибилизацию масла чайного дерева и колофония. Там только отмечалось совпадение положительных кожных аллергических проб на оба вещества. Но причинная связь  между этими двумя веществами не доказана (17).

            Предпринимались определенные попытки по обнаружению компонентов масла чайного дерева, которые, могли бы отвечать за аллергические реакции. Среди таких компонентов назывались 1,8- цинеол, (3), D- лимонен, a-терпинен, аромадендрен, терпинен-4-ол, a-фелландрен, п-цимен, a-пинен, терпинолен (18) и a-терпинен (19). В других работах (20, 21) в качестве наиболее вероятных аллергенов назывались продукты окисления. Поскольку окисленное масло чайного дерева является более сильным аллергеном, чем свежее масло, частоту нежелательных реакций можно свести к минимуму не допуская применения старого окисленного масла. Также проводилась работа по определению степени этих эффектов, приемлемых параметров стабильности, соответствующей технологии производства готовой продукции и процедур хранения.

            Данные in vitro исследований показывают, что масло чайного дерева (M. alternifolia) является потенциально полезным местным антимикробным средством (22-24), и последние клинические испытания показали многообещающие результаты (25, 26). Вместе с тем, необходимы дополнительные данные о in vivo эффективности и безопасности масла чайного дерева. Однако для объективной оценки биологических свойств масла чайного дерева, включая и его аллергенности, в литературе должна сообщаться точная информация как о самом масле, так и о его свойствах.

Списоклитературы

1. Vilaplana J, Romaguera C. Allergic contact dermatitis due to eucalyptol in an anti-inflammatory cream. Contact Der­matitis 2000: 43: 118.

2. Vander Valk PGM, De GrootAC, Bruynzeel D P, Coenraads P J, Weijland J W. Allergic contact dermatitis from 'tea tree' oil. Ned Tijdschr Geneeskd 1994: 138: 823-825.

3. De Groot A C, Weyland J W. Systemic contact dermatitis from tea tree oil. Contact Dermatitis 1992: 27: 279-280.

4. International Organisation for Standardisation. Essential oils - oil of Melaleuca, терпинен-4-ол type (tea tree oil). ISO-4730. Geneva: International Organisation for Standardis­ation, 1996.

5. Treudler R, Richter G, Geier J, Schnuch A, Orfanos C E, Tebbe B. Increase in sensitization to oil of terpentine: re­cent data from multicenter study on 45,005 patients from the German-Austrian Information Network of Depart­ments of Dermatology (IVDK). Contact Dermatitis 2000: 42: 68-73.

6. Selvaag E, Eriksen B, Thune P. Contact allergy to tea tree oil and cross-sensitisation to colophony. Contact Derma­titis 1994: 31: 124-125.

7. Selvaag E, Holm J-O, Thune P. Allergic contact dermatitis in an aromatherapist with multiple sensitizations to essen­tial oils. Contact Dermatitis 1995: 33: 354-355.

8. Bhushan M, Beck M H. Allergic contact dermatitis from tea tree oil in a wart paint. Contact Dermatitis 1997: 36: 117-118.

9. Guin J D, Kincannon J. Medication-induced contact reac­tions. Clin Dermatol 1997: 15: 511-525.

10. Standards Association of Australia. Australian standard for essential oils - oil of Melaleuca, терпинен-4-ол type (AS 2782-1985). Sydney: Standards Association of Australia, 1985.

11. Brophy J J, Davies N W, Southwell I A, Stiff I A, Williams L R. Gas chromatographic quality control for oil of Mela-leuca терпинен-4-ол type (Australian tea tree). J Agric Food Chem 1989: 37: 1330,1335.

12. Southwell I A. Tea tree constituents. In: Southwell I, Lowe R (eds): Tea tree: the genus Melaleuca. Singapore: Har-wood Academic Publishers, 1999: 29-62.

13. Weiss E A. Essential oil crops. Oxford: CAB International, 1997: 302-319.

14. Lassak E V, McCarthy T M. Australian Medicinal Plants. Sydney, New South Wales: Methuen Australia, 1983.

15. Perry N B, Brennan N J, Van Klink J W, Harris W, Douglas M H, McGimpsey J A, Smallfield B M, Andersen R E. Essential oils from New Zealand manuka and kanuka: chemotaxonomy of Leptospermum. Phytochemistry 1997: 44: 1485-1494.

16. Apted J H. Contact dermatitis associated with the use of tea tree oil. (Letter) Australas J Dermatol 1991: 32: 177.

17. De Groot A C. Airborne allergic contact dermatitis from tea tree oil. Contact Dermatitis 1996: 35: 304-305.

18. Knight T E, Hausen B M. Melaleuca oil (tea tree oil) der­matitis. J Am Acad Dermatol 1994: 30: 423-427.

19. Southwell I A, Freeman S, Rubel D. Skin irritancy of tea tree oil. Journal of Essential Oil Research 1997: 9: 47-52.

20. Hausen B M, Reichling J, Harkenthal M. Degradation products of monoterpenes are the sensitizing agents in tea tree oil. Am J Contact Dermatitis 1999: 10: 68-77.

21. Harkenthal M, Hausen B M, Reichling J. 1,2,4-trihydroxy-menthane, a contact allergen from oxidized Australian tea tree oil. Pharmazie 2000: 55: 153-154.

22. Carson C F, Cookson B D, Farrelly H D, Riley T V Suscep­tibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Antimicrob Chem-other 1995: 35: 421-424.

23. Hammer K A, Carson C F, Riley T V. Susceptibility of transient and commensal skin flora to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Am J Infect Control 1996: 24: 186-189.

24. Harkenthal M, Reichling J, Geiss H K, Saller R. Compara­tive study on the in vitro antibacterial activity of Australian tea tree oil, cajuput oil, niaouli oil, manuka oil, kanuka oil, and eucalyptus oil. Pharmazie 1999: 54: 460,463.

25. Jandourek A, Vaishampayan J K, Vazquez J A. Efficacy of melaleuca oral solution for the treatment of fluconazole refractory oral candidiasis in AIDS patients. AIDS 1998: 12: 1033-1037.

26. Caelli M, Porteous J, Carson CF, Heller R, Riley T V Tea tree oil as an alternative topical decolonization agent for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect 2000: 46: 236-237.

Влияние органики, катионов и поверхностно-активных веществ  на антимикробнуюактивность масла Melaleucaalternifolia(чайное дерево) invitro

K.A. Hammer¹, C.F. Carson¹ иT.V. Riley^1,2

¹Отделение микробиологии, университет Западной Австралии

²Отделение микробиологии и инфекционных болезней медицинского центра патологии и медицинских исследований Западной Австралии им. королевы Елизаветы II, Недлендс, Западная Австралия

k.a. hammer, c.f. carson and t.v. riley. 1999. Исследовалось влияние определенных органических веществ и условий на антимикробную активность масла Melaleuca alternifolia (чайное дерево). Разведением в бульоне и в агаре определялась минимальная ингибирующая и цидальная концентрация масла чайного дерева отдельно и в присутствии посторонних органических веществ. Активность исследовалась в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к Candida albicans. Оценена минимальная ингибиторная и минимальная цидальная концентрации, отличающиеся от контролей на два и более разведения, по отношению к одному или нескольким тестовым микроорганизмам в присутствии таких посторонних веществ, как Твин-20, Твин-80, порошок снятого молока и бычий сывороточный альбумин. Исследование не обнаружило отличий при выполнении анализов в анаэробных условиях, или в присутствии ионов кальция и магния. Влияние органики на антимикробную активность масла чайного дерева исследовалось тестом нейтрализации органического грунта. Исследуемые микроорганизмы подвергались воздействию летальных концентраций масла чайного дерева (начиная от 1,10 об.%) в присутствии сухих пекарских дрожжей 1,30% (мас./об.). После десятиминутного контакта определялась жизнеспособность микроорганизмов. При уровнях ≥ 1% органика ослабляла активность всех исследуемых концентраций масла чайного дерева по отношению к Staphylococcus aureus и C. albicans. Что касается Pseudomonas aeruginosa, то активность масла чайного дерева ослаблялась при содержании органики более 10%. В экспериментах с Escherichia coli органика ослабляла активность концентраций масла чайного дерева 1 и 2%, и не влияла на активность при концентрациях 4 и 8%. Сделан вывод о том, что органические и поверхностно-активные вещества ослабляют антимикробную активность масла чайного дерева, хотя это действие для различных микроорганизмов проявляется в разной степени.

ПРЕДИСЛОВИЕ

Эфирное масло, получаемое из произрастающего в дикой природе Австралии растения Melaleucaalternifolia,называют маслом чайного дерева. Это масло содержит более 100 компонентов, из которых большая часть это монотерпены, сесквитерпены и их спирты (Brophyс соавторами, 1989). Международный стандарт 4730 по маслу мелалеуки терпинен-4-ол типа (масло чайного дерева) приводит хроматографические профили, которые устанавливают максимальное и минимальное процентное содержание 14 компонентов масла (Международная организация стандартизации, 1996 г.). Это позволяет выполнять оценку качества промышленно выпускаемого масла чайного дерева.

Масло чайного дерева применяется местно для лечения различных кожных нарушений, в частности, угрей, опоясывающего лишая, реакций на укусы насекомых и ожоги (Altman1989), т.к. масло обладает антимикробными свойствами и известными противовоспалительными, проникающими и обезболивающими эффектами (Carsonи Riley1993). Первыми для медицинских целей растение M. alternifoliaначали применять аборигены племени Бунджалунг в северной части Нового Южного Уэльса, где это растение произрастает в дикой природе (Carsonи Riley1993). Масло с переменным успехом сначала получило распространение в Австралии и сегодня входит в состав многочисленных косметических и фармацевтических продуктов, выпускаемых во всем мире (Carsonи Riley1993; Knightи Hausen1994).

            Последние исследования масла чайного дерева были сфокусированы на изучении его бактерицидных (Hammerс соавторами, 1996), противогрибковых (Nenoffс соавторами, 1996) и, в меньшей степени, противовирусных свойств этого масла (Bishop1995). Намного меньше известно о механизме действия масла на микроорганизмы (Gustafsonс соавторами, 1998), о потенциальных эффектах других веществ и об условиях, способных влиять на антимикробную активность масла. Несмотря на отсутствие доказательств, получило широкое распространение мнение, что антимикробные свойства масла чайного дерева сохраняются или даже усиливаются в присутствии крови или гноя, которое впервые было высказано Humphery1930, Penfoldи Morrison1937. По этой причине было решено оценить различные факторы, способные влиять на эффекты масла, а также антимикробную активность масла чайного дерева к различным микроорганизмам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Масло чайного дерева

Масло чайного дерева (МЧД) для исследований было любезно предоставлено компанией AustralianPlan­tationsPtyLtd, Вираллах/Wyrallah, штат Новый Южный Уэльс (НЮУ), Австралия. Партии 93/04 и 971 соответствовали требованиям стандарта ISO4730. Содержание определенных компонентов определялось газовой хроматографией и масс-спектрофотометрией в сельскохозяйственном институте WollongbarAgriculturalInstitute, Воллонгбар/Wollongbar, шт. НЮУ, Австралия. По результатам исследования партия 93/04 содержала 37,1% терпинен-4-ола и 3,2% 1,8-цинеола. Партия 971 содержала 41,5% терпинен-4-ола, 21,2% g-терпинена, 10,2% a-терпинена, 3,5% терпинолена, 2,9% a-терпинеола, 2,5% a-пинена, 2,1% 1,8-цинеола и 1,5% п-цимена.

Тестовые микроорганизмы и приготовление инокулята

            Микроорганизмы для исследований были получены из коллекций культур отделения микробиологии университета Западной Австралии и из отделения микробиологии и инфекционных болезней Западно-австралийского центра патологии и медицинских исследований. Использовались следующие изоляты: AcinetobacterbaumaniiNCTC7844, AeromonasveroniibiogroupsobriaATCC9071(Aer. sobria), CandidaalbicansATCC10231, EnterococcusfaecalisNCTC8213, EscherichiacoliNCTC10418, KlebsiellapneumoniaeNCTC11228, PseudomonasaeruginosaNCTC10662, Salmonellaentericasubsp. entericaserotypetyphimuriumNCTC74(Salm. typhimurium), Ser-ratiamarcescensNCTC1377andStaphylococcusaureusNCTC6571. Все изоляты поддерживались на кровяном агаре. Ночные культуры готовились инокуляцией 2-3 колоний на 2-3 мл бульона Мюллера-Хинтона (БМХ) с последующей инкубации на протяжении ночи при 35 °Cс периодическим встряхиванием. Для анализа разведений в агаре выполнялось разведение ночных культур в физрастворе примерно до 10⁶ или 10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл^-1  для соответственно C. albicansи бактерий, что соответствовало примерно 10³ или 10⁴ КОЕ/мл инокуляционного пятна. Для анализа разведений в бульоне выполнялось разведение культур до конечной концентрации инокулята примерно 5 x10⁵ КОЕ/мл с подтверждением подсчетом количества жизнеспособных микроорганизмов.

Определение МИК и МЦК

            Анализы разведений в агаре выполнялись добавлением МЧД (партия 93/04) в двойных разведениях с 2% до 0,03% (об./об.) на агаре Мюллера-Хинтона (АМХ) без или в присутствии исследуемого вещества. Для улучшения растворимости масла все разведения содержали полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (Твин-20) в конечной концентрации 0,5% (об./об.). В качестве контроля использовался кровяной агар или агар с 0,5% Твин-20, содержащий в зависимости от основного испытания или не содержащий соответствующее исследуемое вещество. Чашки сушились 30 минут и затем при помощи многоточечного репликатора (MastLaboratoriesLtd, Ливерпуль, Великобритания) выполнялась инокуляция четырех инокуляционных пятен каждой изоляты. Чашки инкубировались при 35 °C, после чего определялась минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для бактерий через 24 часа и для C. Albicansчерез 48 часов. В данном исследовании применялось следующее определение МИК: наименьшая концентрация масла чайного дерева, предупреждающая видимый рост одной или двух колоний. Анализы разведений в агаре в присутствии посторонних веществ выполнялись по одному разу.

            Анализы микроразведений в бульоне выполнялись добавлением МЧД (партия 93/04) к БМХ серией двойных разведений с 5% до 0,03% в присутствии каждого исследуемого постороннего вещества и без них. Для улучшения растворимости масла все разведения содержали Твин-20 в конечной концентрации 0,001% (об./об.). Применялись два контроля роста. Один – это БМХ с 0,001% Твин-80 и второй – БМХ с 0,001% Твин-80, плюс соответствующее постороннее исследуемое вещество. Микротитрационные планшеты инокулировались микроорганизмами и инкубировались при температуре 35 °C. После 24 часов в случае исследования бактерий или после 48 часов для C. albicansиз каждой лунки планшета бралось по 10 мл субкультур и выполнялась пятненная инокуляция на АМХ. После инкубации субкультур определялись МИК и МЦК. В данном исследовании МИК определялась, как наименьшая концентрация масла чайного дерева, вызывающая сохранение или уменьшение инокулята, а МЦК – наименьшая концентрация масла, при которой наступает гибель 99,9% инокулята. Анализы разведений в бульоне выполнялись по два раза. В случае различия результатов, тесты повторялись и брались наиболее вероятные значения.

Эффект анаэробных условий

            Анаэробные условия создавались в анаэробной камере (DonWhitleyScientificLtd, Шипли, Великобритания) с атмосферой 10% H₂, 10% CO₂и 80% N₂. При приведении анализов разведений в агаре (партия 93/04) выполнялась инкубация в аэробных условиях 48 часов и затем определялись значения МИК. Эти опыты выполнялись по три раза, и бралось наиболее вероятное значение. При анализах разведений в бульоне (партия 971) микротитрационные планшеты помещались в анаэробную камеру не менее чем на 2 часа, и затем выполнялась инокуляция. Сразу после инокуляция планшеты возвращались в анаэробную камеру и субкультуры выращивались на протяжении 24 часов в случае бактерий или 48 часов для C. albicans.

Влияние катионов

            Готовился бульон Мюллера-Хинтона в жесткой воде, содержащей 0,304 г/л CaCl₂и 0,065 г/л MgCl₂(Graham1978). Кроме того, в БМХ готовились растворы, содержащие 50 ммоль/л Ca²⁺и (или) Mg²⁺.

Влияние органических веществ

            Исследовались следующие органические вещества (в одной или нескольких концентрациях): овечья кровь (об./об.), лошадиная сыворотка (об./об.), бычий сывороточный альбумин (БСА) (мас./об.), сухие пекарсике дрожжи (мас./об.) и порошковое снятое молоко (мас./об.) (UnipathLtd, Басингсток, Великобритания). Бычий сывороточный альбумин растворяли в дистиллированной воде и после стерилизации фильтрованием добавлялся в стерильную среду. Пекарские дрожжи и порошковое снятое молоко растворяли в БМХ или АМХ и затем стерилизовали в автоклаве.

Влияние поверхностно-активных веществ

            После стерилизации среды в автоклаве в асептических условиях (расчет об./об.) добавлялись следующие посторонние вещества: Твин-20, Твин-80 и алкилдиметилетаин (АДБ) (EmpigenBB) (Albrightи Wilson, WetherillPark, НЮУ, Австралия). В БМХ растворяли монододецилсульфат натрия (МСН) (мас./об.) и затем выполняли автоклавирование.

Метод Уайтмора-Минера

            Предварительно проводились эксперименты по определению количества масла чайного дерева, полностью убивающего весь инокулят согласно параметрам методики Уайтмора и Минера (Whitmoreи Miner, 1976). Микроорганизмы инокулировались в растворы масла чайного дерева (партия 971) следующих концентраций (% об./об.): 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 и 10. Инкубация, субкультивирование и регистрация роста выполнялись согласно приведенному ниже описанию. Эта процедура повторялась в другие дни до тех пор, пока для каждого микроорганизма не подбиралась наиболее вероятная минимальная летальная концентрация (МЛК). После этого выполнялись тесты нейтрализации органического грунта при значениях концентрации МЧД больше или равно МЛК соответствующего микроорганизма.

            Сухие пекарские дрожжи измельчались до однородной консистенции по описанию Уайтмора и Минера (1976) и в стеклянных сосудах Маккартни взвешивались следующие количества дрожжей: 3, 2, 1, 0,5 и 0,1 г. После автоклавирования образовавшиеся комки разбивались вихревой мешалкой. В стерильной дистиллированной воде готовились растворы МЧД с конечной концентрацией Твин-80 0,001%. Через точно отмеренные интервалы времени 10 мл раствора МЧД добавлялось к каждой порции сухих дрожжей, смесь перемешивалась вихревой мешалкой и 2 часа инкубировалась при 25 °Cв водяной бане. Каждая серия включала контрольный раствор МЧД без дрожжей. Через 2 часа по 100 мкл суспензии с примерно 10⁸ КОЕ/мл Staph. aureus, E. coliили Ps. aeruginosa, или 10⁷ КОЕ/мл при исследовании C. albicansс заданной периодичностью инокулировались на серии смеси дрожжи/МЧД. Содержимое всех пробирок непосредственно до и после инокуляции перемешивалось вихревой мешалкой. Пробирки возвращались в водяную баню, и через 10 минут бралось по 1 мл смеси дрожжи/МЧД/микроорганизм и добавлялось в 9 мл питательного бульона №2 (ПБ №2). Из этой начальной субсультуры в ПБ №2 готовилось два дополнительных разведения одного из 10 последовательных разведений.   Пробирки с субкультурами инкубировались 48 часов при 35°C. После этого отмечалась мутность бульона и на питательный агар (ПА) выполнялась пятненная инокуляция 25 мкл аликвотных проб из каждой пробирки. После инкубации чашек ПА отмечалось наличие или отсутствие роста. Рост любой субкультуры фиксировался как общий положительный результат. Тесты с каждым исследуемым микроорганизмом выполнялись не менее двух раз в разные дни. Бралось наиболее вероятное значение положительного или отрицательного роста каждой смеси дрожжи/МЧД/микроорганизм. Число нейтрализации рассчитывалось умножением на 10 максимального количества дрожжей, не показавших роста во всех пробирках с субкультурами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние анаэробных условий

Как видно из таблицы 1, значения МИК и МЦК полученные в аэробных и анаэробных условиях отличались не более, чем на одно разведение.

Анализы разведений в бульоне и в агаре

Результаты анализов разведений в бульоне и в агаре в присутствии посторонних исследуемых веществ показаны в таблице 2. Анализы с добавлением Твин-80 для A. baumanii, Aer. sobria, Ent. faecalis, E. coliиStaph. Aureusпоказали МИК на два последовательные разведения больше контроля. Остальные значения МИК были равны или отличались на одно разведение. Результаты анализов микроразведений в бульоне в присутствии посторонних веществ показаны в таблице 3. Значения МИК и МЦК в присутствии катионов были равны или отличались на одно разведение. Для Staph. aureusМЦК в присутствии БСА и снятого молока были больше на два разведения. Для C. albicansМИК в присутствии БСА были больше на два разведения. Для C. albicansМИК и МЦК в присутствии 10% Твин-20 были больше также на два разведения. Все значения МИК и МЦК в присутствии 5% и 10% Твин-80 были больше на два разведения, за исключением МИК и МЦК для E. coliи МЦК для C. albicansв присутствии 5% Твин-80. Поверхностно-активные вещества МСН и АДБ препятствовали росту определенных тестовых микроорганизмов.

Метод Уайтмора-Минера

Результаты экспериментов по Уайтмору-Минеру показаны в таблице 4. Были получены следующие значения МЛК: для E. coli0,5%, Staph. aureus4,0%, Ps. aeruginosa1,0% и для C. albicans2,0%. Присутствие дрожжей ослабляло летальные эффекты двух и более концентраций МЧД по отношению к тестовым микроорганизмам. Так, летальные для Staph. aureusиC. albicansконцентрации МЧД в присутствии 0,1 г дрожжей не убивали эти микроорганизмы.

Таблица 1. Значения МИК и МЦК (% об./об.) масла чайного дерева для различных микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях по результатам анализов разведений в агаре и бульоне.

Таблица 2. Значения МИК (% об./об.) масла чайного дерева, полученные методом разведений в агаре отдельно и в присутствии 5% посторонних веществ с потенциальным влиянием на МЧД.

* н.о. – не определено.

При концентрации МЧД меньше 4%, дрожжи ослабляли летальные эффекты МЧД на E. coli, однако при концентрации больше 4% наличие дрожжей не оказывало ослабляющего действия на летальность МЧД. Что касается Ps. aeruginosa, то концентрации МЧД 2% и 4% в присутствии ≥ 0,1 г дрожжей не обеспечивали гибели инокулята. Тесты с C. albicansпри концентрациях МЧД 8% и 10% показали невоспроизводимые результаты, поэтому выбрать наиболее вероятное значение не удалось. Наблюдался рост Staphylococcusaureusв пробирках с субкультурой в присутствии количеств МЧД более МИК (0,25%) и MBC(0,5%), но лишь в тех тестах, в которых количество дрожжей составляло 1, 2 или 3 г (данные не показаны). Во всех субкультурах, содержащих МЧД в количествах выше соответствующих значений МИК или МЦК рост Escherichiacoliи C. albicansне наблюдался. Все микроорганизмы в одном или нескольких опытах показали рост при последовательном разведении 10^-3, а при разведениях 10^-1 и 10^-2 рост отсутствовал. Добавление последовательного разведения 10^-4 не улучшило восстановления микроорганизмов, т.к. если рост происходил при разведении 10^-3, то он был неизбежен и при разведении 10^-4.

ОБСУЖДЕНИЕ

            В представленном сниманию читателя исследовании изучалось влияние различных посторонних веществ и условий на антимикробную активность масла чайного дерева. Эксперименты показали, что присутствие катионов или анаэробные условия не оказывают негативного влияния, но присутствие поверхностно активных веществ и органического материала ухудшает эффективность МЧД.

Влияние катионов на активность антимикробных соединений может объясняться образованием хелатов между ионами и антимикробным веществом, а также защитой внешних мембран бактерий от потери катионов под влиянием антимикробного агента (Marshallи Piddock1994). Предполагалось, что анаэробные условия могут усилить антимикробную активность МЧД за счет химической перестройки компонентов масла в более активные антимикробные соединения, или же за счет изменения микробного метаболизма, затрагивающего поглощение и (или) активацию МЧД (Parkс соавторами 1992). Однако обнаруженное в данном исследовании отсутствие влияния этих условий на антимикробную активность заставляет предположить отличающееся от указанных механизмов действие МЧД.

Известна способность поверхностно-активных веществ ослаблять активность многих антимикробных веществ, и они давно применяются в качестве стандартных нейтрализаторов фенолов, крезолов и четвертичных аммониевых соединений (Bloomfield1991; Russellс соавторами, 1992). ПАВ также ослабляют активность эфирных масел (Remmalс соавторами 1993), включая и масло чайного дерева (Carsonи Riley1996). Предполагается, что ПАВ влияют на антимикробную активность растворяющих молекул антимикробного вещества заключая их внутри мицелл ПАВ, в результате чего ограничиваются возможности антимикробного вещества воздействовать на микроорганизмы (Allwoodи Shaw1987; Russellс соавторами, 1992). Также было продемонстрировано, что в достаточно высоких концентрациях некоторые ПАВ сами способны оказывать летальное действие на микроорганизмы (Russellи Chopra1990).

Таблица 3. Значения МИК и МЦК (% об./об.) масла чайного дерева, полученные методом микроразведений в бульоне отдельно и в присутствии посторонних веществ с потенциальным влиянием на МЧД.

О.Р. – отсутствие роста.

н.о. – не определено.

            Результаты анализов микроразведений в бульоне и экспериментов по Уайтмору-Минеру показали, что органика ослабляет антимикробную активность МЧД. Одним из объяснений этого явления может быть взаимодействие между органическим веществом и активными участками антимикробного вещества, сопровождающееся снижением концентрации активного антимикробного вещества (Gormanи Scott1980). Если имеет место именно такое взаимодействие, то должно было происходить одинаковое ослабление активности по отношению ко всем исследуемым микроорганизмам. Однако анализ разведений в бульоне показал, что ни одно исследуемое органического вещество отдельно не ослабляло активности МЧД к трем тестовым микроорганизмам. Это заставляет предположить, что если и имеет место именно этот механизм ослабления антимикробной активности, то он проявляется согласованно с другими специфическими для микроорганизмов факторами. На такие специфические для микроорганизмов факторы также указывают отличия результатов разных микроорганизмов, наблюдаемые в экспериментах по Уайтмору-Минеру. Специфичность по отношению к микроорганизмам можно объяснить гидростатическим сцеплением органического вещества с микробной клеткой, которое защищает клетку от воздействия антимикробного агента (Gormanи Scott1980; Gorbachс соавторами, 1992; Russellс соавторами, 1992). Кроме того, возможно, упоминаемое выше взаимодействие между органическим и антимикробным веществами приводит к образованию форм, которые хуже поглощаются некоторыми микроорганизмами (Bean1967).

Таблица 4. Рост микроорганизмов в субкультурах после экспозиции масла чайного дерева (% об./об.) в присутствии разных количеств дрожжей.

–: отсутствие роста во всех разведениях субкультур;

+: рост в одной или несколькихразведениях субкультур.

            Это исследование показало, что лишь органика определенных типов влияет на антимикробную активность МЧД. Ранее подобный эффект уже наблюдался, и предполагалось, что эти различия могут быть обусловлены отличиями относительной растворимости и содержания белка в органике разных типов (Gelinasи Goulet1983).

            Анализы разведений в агаре и бульоне показали несовпадающие вещества, влияющие на антимикробную активность МЧД. Это несоответствие может объясняться различиями анализов по росту микроорганизмов и экспозиции антимикробным агентом (Riosс соавторами, 1988; Hiliс соавторами, 1997). Присутствие дрожжей хотя достоверно и не влияло на результаты анализов разведений в агаре и в бульоне, эксперименты по Уайтмору-Минеру показали явное влияние дрожжей на антимикробную активность. Возможно, это следствие существенных методологических отличий, например, продолжительности экспозиции МЧД на микроорганизмы и температуры проведения анализов.

            Методику Уайтмора-Минера можно усовершенствовать выполнением подсчета жизнеспособных микроорганизмов вместо сообщения результата как положительный или отрицательный рост. Это позволит повысить воспроизводимость, поскольку результаты «положительный рост»/«отрицательный рост» сильно искажаются ошибками выборки (Coates1988; Bloomfield1991; Minerс соавторами, 1997). Подсчет числа жизнеспособных микроорганизмов позволит рассчитывать логарифмический показатель снижения численности – параметр, широко применяемый для измерения антимикробной активности веществ (Coates1988). Кроме того, методику можно дополнить несколькими (вместо одного) моментами времени, что позволит исследовать изменения антимикробной активности как функцию от времени.

Все влияющие на активность взаимодействия позволяют лучше понять механизм действия МЧД, о котором достаточно мало известно (Gustafsonс соавторами 1998). Среди интересных гипотез можно выделить следующие: механизмы антимикробного действия разные для разных типов микроорганизмов; или, поскольку МЧД содержит более 100 компонентов, то они могут действовать по-разному, и некоторые из них могут синергически воздействовать на микробные клетки. Проведенные ранее исследования показали разную степень активности определенных компонентов МЧД по отношению к микроорганизмам (Carsonи Riley1995). Поэтому могут оказаться полезными исследования очищенных компонентов. Другим интересным направлением является исследование каких-то других факторов или условий, способных влиять на антимикробную активность МЧД, например, рН и температуры. Также будет полезной идентификация веществ, нейтрализующих активность МЧД, поскольку во многих исследованиях антимикробной активности применяется один или несколько нейтрализаторов для остановки текущих эффектов антимикробных агентов и микробных клеток (Russellс соавторами 1992).

Также пока остаются малоизученными взаимодействия между местно применяемым МЧД и органическим дебрисом кожи, слизистых оболочек или ран. Вместе с тем, эти органические вещества могут влиять на клиническую эффективность МЧД или получаемых на его основе препаратов. На клиническую эффективность также может повлиять состав фармацевтического средства с МЧД. Не исключено, что кроме поверхностно-активных веществ другие наполнители фармацевтической формулы также способны ослаблять активность антимикробных компонентов (Allwoodи Shaw1987), в том числе и МЧД.

Итак, данная работа показала, что поверхностно-активные вещества ослабляют антимикробную активностью МЧД, вероятнее всего, за счет мицеллярной солюбилизации. Органика также оказывала подобное влияние на активность, скорее всего при помощи не одного, а нескольких механизмов, в том числе и реакций между органикой и МЧД в сочетании со специфическими для данного микроорганизма факторами. Подобные взаимодействия способны влиять на клиническую эффективность МЧД и получаемых на его основе препаратов, поэтому требуют дальнейшего изучения.   

БЛАГОДАРНОСТЬ

Эта работа была выполнена при поддержке компании Australian Bodycare Cor­poration Pty Ltd, Currumbin, шт. Новый Южный Уэльс, Австралия и, частично, на средства гранта от Rural Industries Research и Devel­opment Corporation (UWA-24 A).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Allwood, M.C. and Shaw, R.J.S. (1987) Preservation of mixtures, suspensions and syrups. In Preservatives in the Food, Phar­maceutical and Environmental Industries ed. Board, R.G., Allwood, M.C. and Banks J.G. pp. 197-210. Oxford, UK: Blackwell Scien­tific Publications.

Altman, P.M. (1989) Australian tea tree oil - a natural antiseptic. Australian Journal of Biotechnology 3, 247-248.

Bean, H.S. (1967) Types and characteristics of disinfectants. Journal of Applied Bacteriology 30, 6-16.

Bishop, C.D. (1995) Antiviral activity of the essential oil of Mel-aleuca alternifolia (Maiden and Betche) Cheel (tea tree) against tobacco mosaic virus. Journal of Essential Oil Research 7, 641-644.

Bloomfield, S.F. (1991) Methods for assessing antimicrobial activity. In Mechanisms ofAction ofChemical Biocides, Their Study and Exploitation ed. Denyer, S.P. and Hugo, W.B. pp. 1-22. Oxford, UK: Blackwell Scientific Publications.

Brophy,J.J., Davies, N.W., Southwell, I.A., Stiff, I.A. and Williams, L.R. (1989) Gas chromatographic quality control for oil of Mel-aleuca terpinen-4-ol type (Australian tea tree). Journal ofAgri-cultural and Food Chemistry 37, 1330-1335.

Carson, C.F. and Riley, T.V. (1993) Antimicrobial activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Letters in Applied Micro­biology 16, 49-55.

Carson, C.F. and Riley, T.V. (1995) Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Journal of Applied Bacteriology 78, 264-269.

Carson, C.F. and Riley, T.V. (1996) Working with and against tea tree oil - issues of synergy and antagonism. Abstract 8. In Program and Abstracts of the 19th International Federation of the Societies ofCosmetic Chemists Congress. Sydney, Australia: International Federation of the Societies of Cosmetic Chemists.

Coates, D. (1988) Comparison of sodium hypochlorite and sodium dichloroisocyanurate disinfectants: neutralization by serum. Jour­nal of Hospital Infection 11, 60-67.

Gelinas, P. and Goulet, J. (1983) Neutralisation of the activity of eight disinfectants by organic matter. Journal ofApplied Bac­teriology 54, 243-247.

Gorbach, S.L., Bartlett, J.G. and Blacklow, N.R. (1992) Infectious Diseases. Philadelphia, USA: W.B. Saunders, Company.

Gorman, S.P. and Scott, E.M. (1980) A review. Antimicrobial activity, uses and mechanism of action of glutaraldehyde. Journal ofApplied Bacteriology 48, 161-190.

Graham, B.M. (1978) The development of Australian legislation for disinfectants. Australian Journal ofHospital Pharmacy8, 149-155.

Gustafson, J.E., Liew, Y.C., Chew, S. et al. (1998) Effects of tea tree oil on Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology 26, 194­198.

Hammer, K.A., Carson, C.F. and Riley, T.V. (1996) Susceptibility of transient and commensal skin flora to the essential oil of Mel-aleuca alternifolia (tea tree oil). American Journal ofInfection Con­trol 24, 186-189.

Hili, P., Evans, C.S. and Veness, R.G. (1997) Antimicrobial action of essential oils: the effect of dimethylsulfoxide on the activity of cinnamon oil. Letters in Applied Microbiology 24, 269-275.

Humphery, E.M. (1930) A new Australian germicide. Medical Jour­nal ofAustralia 1, 417-418.

International Organisation for Standardization (1996) ISO 4730 Oil of Melaleuca, terpinen-4-ol type (tea tree oil). Switzerland: Inter­national Organisation for Standardization.

Knight, T.E. and Hausen, B.M. (1994) Melaleuca oil (tea tree oil) dermatitis. Journal ofthe American Academy ofDermatology 30, 423-427.

Marshall, A.J.H. and Piddock, L.J.V. (1994) Interaction of divalent cations, quinolones and bacteria. Journal ofAntimicrobial Chemotherapy34, 465-483.

Miner, N., Armstrong, M., Carr, C.D., Maida, B. and Schlotfeld,L. (1997) Modified quantitative Association of Official Analytical Chemists Sporicidal test for liquid chemical germicides. Applied and Environmental Microbiology63, 3304-3307.

Nenoff, P., Haustein, U.-F. and Brandt, W. (1996) Antifungal activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) against pathogenic fungi in vitro. Skin Pharmacology 9, 388-394.

Park, M.K., Myers, R.A.M. and Marzella, L. (1992) Oxygen ten­sions and infections: modulation of microbial growth, activity of antimicrobial agents, and immunologic responses. Clinical Infec­tious Diseases 14, 720-740.

Penfold, A.R. and Morrison, F.R. (1937) Some notes on the essential oil of Melaleuca alternifolia. Australian Journal ofPharmacy 18, 274-275.

Remmal, A., Bouchikhi, T., Tantaoui-Elaraki, A. and Ettayebi, M. (1993) Inhibition of antibacterial activity of essential oils by Tween 80 and ethanol in liquid medium. Journal de Pharmacie deBelgique 48, 352-356.

Rios, J.L., Recio, M.C. and Villar, A. (1988) Screening methodsfor natural products with antimicrobial activity: a review of theliterature. Journal of Ethnopharmacology 23, 127-149.

Russell, A.D. and Chopra, I. (1990) Understanding AntibacterialAction and Resistance. West Sussex, UK: Ellis Horwood Ltd.

Russell, A.D., Hugo, W.B. and Ayliffe, G.A.J. (1992) Principles andPractice ofDisinfection, Preservation and Sterilisation, 2nd edn.Oxford, UK: Blackwell Scientific Publications.

Whitmore, E.J. and Miner, N.A. (1976) Analysis and optimizationof a quantitative organic soil neutralisation test for disinfectants.Journal of the Association of Official Analytical Chemists 59, 1344-1351.

Антимикробное действие масла чайного дерева (Melaleuca alternifolia) на микроорганизмы ротовой полости

Ева Кулик, Кристина Ленкайт и Юрг Майер

Институт профилактической медицины и пероральной микробиологии Центра стоматологии Базельского университета

Резюме

Масло Melaleuca alternifolia (чайного дерева) оказывает антимикробное действие на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и грибков. В данной работе исследовалось in vitro бактериостатическое и фунгицидно/бактерицидное действие раствора масла чайного дерева, нового геля с маслом чайного дерева для перорального применения (ТебодонтÒ), соответствующего геля с наполнителями без активного вещества, раствора хлоргексидина биглюконата и PlakOutÒ в отношении 10 различных видов пероральных микроорганизмов. Показатели минимальной подавляющей концентрации (МПК) для раствора масла чайного дерева описывались диапазоном 0,0293%–1,25%. Показатель минимальной бактерицидно/фунгицидной концентрации (МФБК) колебался для раствора чайного дерева в пределах 0,0521 – 2,5% и для геля с маслом чайного дерева в пределах <0,0098% – 3,33%. При этом наиболее чувствительными бактериями были Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum и Porphyromonas gingivalis, тогда как Streptococcus mutans и Prevotella intermedia показали наиболее низкую восприимчивость. Как для раствора хлоргексидина биглюконата, так и для PlakOutÒ показатели минимальной подавляющей концентрации и минимальной бактерицидно/фунгицидной концентрации находились в пределах <0,0002% – 0,0125%.

Acta Med Dent Helv 5: 125- 130 (2000)

Ключевые слова: масло чайного дерева; Melaleuca alternifolia; пероральные бактерии, антимикробный, минимальная подавляющая концентрация.

Принято к публикации: 20 сентября 2000 года

Адрес для контактов:

Ева Кулик,

Институт профилактической медицины и пероральной микробиологии Центра стоматологии Базельского университета

Генбельштрассе 3, 4056 Базель

Тел.: 061/267 2603, факс.: 061/267 2658

Электронная почта: Eva.Kulik@unibas.ch

Введение

Масло чайного дерева получают из листьев Melaleuca alternifolia, произрастающего в Австралии кустообразного дерева семейства миртовых. Как природный и эффективный микробиоцид это масло достаточно привлекательно для фармацевтического и косметического применения (обзор см. Карсон и Рилей, 1993, Карсон и соавт. 1998, Галле-Хоффман и Кёниг 1999). Масло чайного дерева состоит примерно из ста терпиненов и их спиртов, из которых терпинен-4-ол, a-пинен, линалоол и a-терпинеол считаются важнейшими компонентами с антимикробным действием (Карсон и Рилей, 1995, РамаН и соавт. .1995).

Исследования in vitro показали эффективное антимикробное действие масла чайного дерева и его отдельных компонентов на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и прочих грибков (Карсон и Рилей, 1995, Раман и соавт. 1995, Хаммер и соавт. 1996, Хаммер и соавт. 1998, Маудслей и Керр, 1999, Хаммер и соавт. 2000). В последнее время масло чайного дерева вызывает особый интерес, так как оно обнаружило способность подавлять рост мультирезистентных бактерий. Так, масло чайного дерева in vitro действует против таких проблемных бактерий как метициллин-резистентный золотистый стафилококк, резистентных к гликопептидам энтерококкам, резистентным к гентамицину и, продуцирующих b-лактамазы расширенного спектра Klebsiella, некоторым мультирезистентным псевдомонадам, а также эффективно для клинического лечения инфекций, вызванных резистентными к флуконазолу Candida albicans у пациентов со СПИДом (Карсон и соавт. 1995, Ненофф и соавт. 1996, Чан и Лоудон 1998, .Яндурек и соавт. 1998, Элсон и Гиде 1999, Харкенталь и соавт. 1999, Мэй и соавт. 2000). Действие против вирусов человека пока не доказано, но доказано против вирусов растений (Бишоп, 1995, Бурне и соавт. 1999).

В литературе описано многообещающее клиническое применение масла чайного дерева для локальной терапии легких форм угрей, при онихомикозе и бактериальном вагините (Бассетт и соавт. 1990, Блекуэлл 1991, Хаммер и соавт. 1999а, Тонг и соавт. 1999).

В стоматологии использование этого эфирного масла в качестве антисептика было предложено еще в начале 20-го века (МАКДональд 1930). Вместе с тем, опубликовано лишь 2 исследования, посвященных антимикробному действию масла чайного дерева на пероральные микроорганизмы (Шапиро и соавт. 1994, Велш и Лонгстафф 1987).

Хлоргексидин является наиболее часто применяемым средством профилактики и лечения пероральных инфекций. Несмотря на его высокую эффективность, но обладает нежелательными побочными действиями (Дентон 1991). Поэтому ему ищут альтернативу, в настоящее время – среди природных продуктов.

Целью настоящей работы было исследование бактериостатических или бактерицидно/фунгицидных свойств масла чайного дерева в форме геля перорального применения (ТебодонтÒ, фирма Д-р Вильд и Со АГ, Базель) в отношении пероральных микроорганизмов в сравнении с хлоргексидином. Для этого использовался тест с макроразведением, который позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную бактерицидно/фунгицидную концентрацию (МБФК) в отношении микроорганизмов в жидкой среде.

Материал и методы

Микроорганизмы и условия роста

В данной работе исследовались следующие микроорганизмы: Streptococcus mutans АТСС 25175, Streptococcus sanguis АТСС 10556, Streptococcus anginosus ZIB 6006 (клинический изолят Центра стоматологии (ZfZ) Базель), Actinobacillus actinomycetemcomitans ZIB 1001 (клинический изолят ZfZ Базель), Lactobavillus salivarius подвид salivarius DSM 20555, Actinomyces naeslundii AТСС 12104, Fusobacterium nucleatum, ZIB 2001 (клинический изолят ZfZ Базель), Prevotella intermedia АТСС 25611, Porphyromonas gingivalis ZIB 3071 (клинический изолят ZfZ Базель) и Candida albicans ZIB 9100 (клинический изолят ZfZ Базель). Микроорганизмы культивировались при 36 °С на пластинах с человеческой кровью (Columbia Agar Base [BBL Бектон Дикинсон] с добавлением 4 мг/л гемина, 1 мг/л менадиона и 50 мл/л человеческой крови) при следующих условиях: факультативно-анаэробные бактерии в воздухе + 10% СО₂ в течение 3-5 дней, анаэробные бактерии в 10% СО₂, 10% Н₂, 80% N₂ в течение 10 дней, Candida albicans при аэробных условиях в течение 2 дней.

Микроорганизмы выращивали в следующих жидких средах: бульон Тодда – Гевитта (BBL Бектон Дикинсон) для факультативно-анаэробных бактерий, тиоглюколатная среда (СМ 391 Oxoid) с добавлением 4 мг/л гемина и 1 мг/л витамина К₃ для большинства анаэробных бактерий, среда Cooked Meat (Oxoid) с добавлением 5 г/л дрожжей (Difco), 5 г/л К₂НРО₄, 1 мг/л резазурина и 0,5 г/л цистеингидрохлорида для P. intermedia; колумбийский бульон (BBL Бектон Дикинсон) с добавлением 4 мг/л гемина, 1 мг/л витамина К₃ и 50 мл/л человеческой крови для P. gingivalis; жидкая среда Сабуро (Oxoid) для C. Albicans. Эти среды использовались и в пробах определения МПК и МБФК.

Активные вещества

Масло чайного дерева (партия № 7115, производитель: Main Camp Tea Tree Oil, Баллина, Австралия) было предоставлено фирмой Д-р Вильд и Со, АГ и содержало 37-45% терпинен-4-ола и не более 5% 1,8-синеола. Для улучшения растворимости в водной среде готовился 80% раствор в полисорбате 80 (Sigma-Aldrich Chemie) (Велш и Лонгстафф 1987, Карсон и Рилей, 1995).

Дополнительно исследовался гель, содержащий 10% масла чайного дерева (из масла партия № 7115) и соответствующий гель с наполнителями (Д-р Вильд и Со, АГ, содержащий воду, глицерин, натрий карбоксиметилцеллюлезу, сахарин натрия, гидрированное касторовое масло, метанол и апельсиновое масло) без активного вещества. Контролем служил 10% хлоргексидина биглюконат (больничная аптека в Базеле) и гель Plak-OutÒ (Hawe-Neos Dental, Швейцария).

 Проверяемые вещества исследовались главным образом на отсутствие бактерий.

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) и минимальная бактерицидно/фунгицидная концентрации (МБФК)

Подавление различными активными веществами роста пероральных микроорганизмов определялось с помощью теста макроразведения (NCCLS 1997a, NCCLS 1997b, по Гревеницу и соавт. 1987). Для этого из геля с маслом чайного дерева, из геля-плацебо и из геля Plak-OutÒ готовили исходные растворы1 ггеля на 1 мл 2-концентрированной жидкой питательной среды; для геля с маслом чайного дерева получалась концентрация 5%, а для геля Plak-OutÒ концентрация хлоргексидина составляла 0,1%. Жидкое масло чайного дерева и хлоргексидин разводили в соответственной жидкой питательной среде до 5% и соответственно 0,2% исходного раствора. Все вещества в 2 этапа дополнительно разводились в жидкой питательной среде. Исследовалось 10 разведений каждого проверяемого вещества.

К 2 мл препарата из каждой серии разведения добавляли 100 мкл культуры микроорганизмов, содержащей около 5 х 10⁶ КОЕ/мл, и инкубировали пробу с аэробными и факультативно-анаэробными бактериями 24 часа, а с анаэробными бактериями 5-10 дней в соответствующих условиях. Количество фактически использованных бактерий проверяли с помощью посева на пластины с человеческой кровью. МПК соответствовало самой низкой концентрации активного вещества, при которой в конце периода культивации визуальное исследование не обнаруживало микробного роста. Для определения МБФК из пробирки, в которой не было отмечено микробного роста, 100 мкл жидкости наносили на пластины с человеческой кровью и культивировали. МБФК соответствовало самой низкой концентрации активного вещества, при которой способность к размножению сохраняли не более 1 инокулированных бактерий. Хотя для дрожжевого грибка Candida albicans исследовался лишь один пероральный грибок, в этой работе применялось понятие фунгцидной концентрации, так как это общеупотребительное в литературе выражение. За несколькими исключениями выполнялось по 3 теста.

Результаты

Полученные показатели МПК и МБФК представлены в табл. I и II. Как раствор, так и гель с маслом чайного дерева обнаружили бактерицидное или бактериостатическое действие в отношении проверяемых микроорганизмов. При этом показатели МПК для раствора масла чайного дерева лежали в пределах 0,0293% – 1,25%, а для геля с маслом чайного дерева 0,0082%–1,25%; показатель МБФК находился в диапазоне от 0,0521% до 2,5% (раствор масла чайного дерева ) и от <0,0098% до 3,33% (гель с маслом чайного дерева).

Табл. 1. Средняя минимальная подавляющая концентрация, %

^а) по отношению к концентрации масла чайного дерева;

^б) по отношению к концентрации геля; N ³5%;

^с) по отношению к концентрации хлоргексидина.

Табл. 2. Средняя минимальная бактерицидно/фунгицидная концентрация, %

^а) по отношению к концентрации масла чайного дерева;

^б) по отношению к концентрации геля; N ³5%;

^с) по отношению к концентрации хлоргексидина.

Представляет интерес и подавляющее рост или бактерицидное действие геля-плацебо на некоторые микроорганизмы, например, A. аctinomycetemcomitans, F. nucleatum, Р. gingivalis и C. аlbicans. При одинаковой концентрации активного вещества гель с маслом чайного дерева в этих случаях был эффективнее раствора масла чайного дерева (синергический эффект). Для сравнения определяли показатели МПК и МБФК раствора биглюконата хлоргексидина и Plak-OutÒ (препарат с хлоргексидином). Показатели как МПК, так и МБФК были в пределах <0,0002% - 0,0125%, т.е. значительно ниже, чем полученные для масла чайного дерева.

Обсуждение

Масло чайного дерева часто применяют в косметических продуктах в концентрации 2-5% (Карсон и соавт. 1995). In vitro 2% концентрация как раствора масла чайного дерева, так и геля с маслом чайного дерева подавляла рост всех 10 видов исследованных пероральных бактерий, и для 9 из 10 из них эта концентрация даже превышала МБФК. Для всех бактерий 5% концентрация масла чайного дерева была выше МБФК. Для сравнения определялись значения МПК и МБК раствора хлоргексидина и Plak-OutÒ (содержащего 0,2% хлоргексидина) – двух наиболее часто используемых препаратов для уменьшения количества бактерий в пероральной области. Как и ожидалось, 0,2% концентрация хлоргексидина для всех исследованных видов пероральных бактерий была выше МБФК. Определяемые для хлоргексидина показатели МПК были на коэффициент 100-1000 ниже, чем показатели масла чайного дерева и в основном совпадали с сообщаемыми в литературе значениями (Дентон 1991). Представляет интерес и тот факт, что гель-наполнитель также оказывал подавляющее действие на некоторые микроорганизмы, например, A. Actinomycetemcomitans, C albicans и F. nucleatum. На чем основано это действие, неясно. Этот результат может объяснить определенные различия между действием раствора масла чайного дерева и геля с маслом чайного дерева.

Механизм действия масла чайного дерева объясняется содержащимися в нем терпененами (в том числе терпиненом-4-ол). Они проникают в клеточную мембрану микроорганизмов и оказывают токсическое действие на структуру мембраны и ее функции, в результате чего цитоплазматическая мембрана утрачивает способность исполнять свои функции барьера проницаемости (Кокс и соавт. 1998, Густарзон и соавт. 1998, Кокс и соавт. 2000, Манн и соавт. 2000). О случаях резистентности к маслу чайного дерева пока не известно, хотя широкие исследования по этой теме не проводились.

Масло чайного дерева не мутагенно, а его токсичность с учетом LD₅₀ 1,9 г/кг веса тела для крыс при пероральном приеме можно отнести к умеренной (Карсон и Рилей, 1993, ФОРД 1988). В литературе сообщалось о случаях контактного дерматита и аллергий при местном нанесении (Книгт и Хансен, 1984, Сельфааг и соавт. 1994, Карсон и соавт. 1998), Хаузен и соавт. 1999).

Масло чайного дерева клона 88, нового выведенного сорта с повышенным содержанием активного вещества терпинена-4-ол и пониженным содержанием 1,8-цинеола продемонстрировало in vitro повышенное антимикробное действие, прежде всего против таких проблемных бактерий, как Pseudomonas aeruginosa и метициллин-резистентного золотистого стафилококка (Мей и соавт. 2000). Дальнейшие исследования могли бы способствовать выведению растений с еще лучшим антимикробным действием и меньшей способностью вызывать раздражение кожи.

Действие масла чайного дерева на пероральные микроорганизмы исследовалось Велшем и Лонгстаффом (1987) и Шапиро с соавт. (1994). Сопоставление представлено в табл. III. Для сравнимых штаммов бактерий показатели МПК, полученные в настоящем исследовании, чаще всего были между значениями Шапиро с соавт. (1994) и Велша и Лонгстаффа (1987). Отличия значений МПК могут объясняться тем фактом, что в этих работах использовались другие изоляты бактерий, отличающиеся среды и условия инкубации. Это касается, прежде всего, исследования Велша и Лонгстаффа (1987), в котором субоптимальные среды культивирования могли обуславливать полученные этими авторами самые низкие показатели МПК.

Показатели МПК масла чайного дерева для неоральных микроорганизмов также варьируются в различных работах. Это может объясняться использованием других штаммов, различий постановки теста или отличиями препаратов масла чайного дерева (Карсон и Рилей, 1993, Карсон и Рилей, 1995, Хаммер и соавт. 1998, Галле-Хоффман и Кёниг 1999, Мэй и соавт. 2000). Максимальная концентрация полисорбата 80 в этом исследовании составляла 1,25% в культуре. Хотя полисорбат 80 не обладает существенными ингибирующими свойствами для микроорганизмов, нельзя исключить синергистические или антагонистические действия (Карсон и Рилей 1995, Хаммер и соавт. 1999б). Синтетические моющие средства и присутствие органического материала могут увеличивать показатели МПК или МБК для определенных микроорганизмов (Хаммер и соавт. 1999б), Но пока не исследовалась возможность влияния таких взаимодействий между применяемым местно маслом чайного дерева и органическим материалом кожи или слизистой оболочки на клиническую эффективность масла чайного дерева.

Используемый в этом исследовании тест с макроразведением не дает информации об эффективности in vivo геля с маслом чайного дерева при указанной концентрации. До настоящего момента проведено лишь несколько исследований, которые подтверждают антимикробное действие масла чайного дерева in vivo (Бассетт и соавт. 1990, Бук и соавт. 1994, Яндурек и соавт. 1998, Тонг и соавт. 1999). Так, при легких формах угрей 5% гель с маслом чайного дерева был менее эффективен, чем 5% гель на основе бензоил пероксида, но масло чайного дерева показало лучшую кожную переносимость (Бассетт и соавт. 1990). В другом клиническом исследовании ногти ног 112 пациентов, страдавших онихомикозом, обрабатывали или 100% маслом чайного дерева, или 1% клотримазолом. Через 6 месяцев отсутствовали достоверные отличия клинической оценки обоих способов лечения (Бук и соавт. 1994). У 8 из 12 пациентов с устойчивым к флуконазолу кандидамикозом и ВИЧ, лечение маслом чайного дерева привело к излечению или улучшению ситуации (Яндурек и соавт. 1998).

В 2-х исследованиях масло чайного дерева продемонстрировало более сильную активность против транзиторных бактерий, чем против симбионтной флоры. Это полезная ситуация, поскольку симбионтной флоре приписывают барьерную функцию против колонизации патогенных бактерий (Хаммер и соавт. 1996, Хаммер и соавт. 1999а), Распространяется ли этот эффект и на применение в пероральной области, из настоящей работы заключить нельзя. С S. sanquis и S. sanginosus исследовалось лишь 2 вида пероральных бактерий, которые можно отнести к пероральной симбионтной флоре, но эти виды не имеют особого значения (Слотс, 1979, Мооре и. Мооре 1994).

В этом исследовании определялись показатели МПК и МБФК на планктонной монокультуре. Действие масла чайного дерева на биопленку ротовой полости, образованную зубным налетом, может быть иным. Клинические исследования позволили бы получить ответ на этот вопрос и установить весь спектр возможностей натурального масла чайного дерева в лечении инфекций ротовой полости и пародонтита.

Заключение

Настоящее исследование in vitro показало, что 2% раствор масла чайного дерева и разработанный для перорального применения гель с 2% масла чайного дерева (ТебодантÒ) подавляли рост планктонных монокультур всех 10 исследованных бактерий. Для 9 из 10 этих видов бактерий исследованная концентрация была выше значений минимальной бактерицидно/фунгицидной концентрации, т.е. оказывала уничтожающее действие.

Благодаря демонстрируемому антимикробному действию гель с маслом чайного дерева может рассматриваться в качестве натуральной альтернативы для лечения инфицированной слизистой оболочки рта и пародонта. Но эффективность клинического применения требует дополнительного подтверждения клиническими исследованиями.

Благодарность

Мы благодарим фирму Д-р Вильд и Со, АГ за любезно предоставленные препараты масла чайного дерева и за финансовую поддержку исследования.

Таблица III. Сравнение значений МПК (в %) раствора масла чайного дерева, полученных в настоящем исследовании и в исследованиях Шапиро с соавт. (1994) и Велш и Лонгстафф (1987).

^a Nb – оценка не проводилась.

Список литературы

Bassett I B, Panno wrrz D L, Barnetson R S C: A comparative study of tea-tree oil versus benzoyl peroxide in the treatment of acne. Med J Aust 153: 455-458 (1990).

Bishop C D: Antiviral activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia (Maiden and Betche) Cheel (tea tree) against to­bacco mosaic virus. J Essential Oil Res 7: 641-644 (1995),

Blackwell A L: Tea tree oil and anaerobic (bacterial) vaginosis. Lancet 337; 300 (1991).

Bourne К Z, Bourne N, Heising S F, Stanberry L R: Plant prod­ucts as topical microbiocide candidates: Assessment of in vit­ro and in vivo activity against herpes simplex virus type 2. An­tiviral Res 42: 219-226 (1999),

Buck D S, Nidorf D M, Addino J G: Comparison of two topical preparations for the treatment of onychomycosis: Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and clotrimazole. J Fam Pract 38: 601-605 (1994).

CarsonС F, Cookson В D, Farrelly H D, Riley T: Susceptibil­ity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to the es­sential oil of Melaleuca alternifolia. J Antimicrob Chemother 35:421-424 (1995).

CarsonС F, Riley T V: A review. Antimicrobial activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Lett Appl Microbiol 16: 49-55 (1993).

CarsonС F, Riley T V: Antimicrobial activity of the major com­ponents of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Appl Bacteriol 78: 264-269 (1995),

CarsonС F, Riley T V, Cookson В D: Efficacy and safety of tea tree oil as a topical antimicrobial agent, J Hosp Infect 40:175-178 (1998).

Chan С H, Loudon К W: Activity of tea tree oil on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J Hosp Infect 39: 244-245 (1998).

Cox S D, Gustafson J E, Mann С M, Markham J L, Liew Y C, Hartland R Р, Bell H C, Warmington J R, Wyllie S G: Tea tree oil causes K+ leakage and inhibits respiration in Escherichia coli. Lett Appl Microbiol 26: 355-358 (1998).

Cox S D, Mann С M, Markham J L, Bell H C, Gustafson J E, Warmington J R, Wyllie S G: The mode of antimicrobial ac­tion of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol 88: 170-175 (2000).

DentonG W: Chlorhexidine. In: Block S S (Ed): Disinfection, Sterilization, and Preservation. 4th Edition, Lea & Febiger,Philadelphia, pp. 274-289 (1991).

Elsom G К F, Hide D: Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to tea tree oil and mupirocin. J An­timicrob Chemother 43: 427-428 (1999).

Ford R A: Fragrance raw materials monographs (tea tree oil). Food Chem Toxicol 2: 407 (1988).

Galle-Hoffman U, Konig W A: Teebaumol. Dtsch Apoth Ztg 139: 64-72 (1999).

Gustafson J E, Liew Y C, Chew S, Markham J, BellН C, Wyl­lie S G, Warmington J R: Effects of tea tree oil on Escherichia coli. Lett Appl Microbiol 26:194-198 (1998).

Hammer К A, CarsonС F, Riley T V: Susceptibility of transient and commensal skin flora to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil), Am J Infect Control 24: 186-189 (1996).

Hammer К A, Carson С F, Riley T V: In-vitro activity of essen­tial oils, in particular Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and tea tree oil products, against Candida spp. J Antimicrobial Chemother 42, 591-595 (1998).

Hammer К A, CarsonС F, Riley T V: In vitro susceptibilities of Lactobacilli and organisms associated with bacterial vaginosis to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Antimicrob Agents Chemother 43:196 (1999a).

Hammer К A, CarsonС F, Riley T V: Influence of organic mat­ter, cations and surfactants on the antimicrobial activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil in vitro. J Appl Microbiol 86:446-452 (1999b).

Hammer K A, Carson C F, Riley T V: In vitro activities of ketoconazole, econazole, miconazole, and Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against Malassezia species. Antimicrob Agents Chemother 44: 467-469 (2000).

Harkenthal M, Reichung J, Geiss IIK, Saller R: Comparative study on the in vitro antibacterial activity of Australian tea tree oil, cajuput oil, niaouli oil, manuka oil, kanuka oil, and eucalyptus oil. Pharmazie 54: 460-463 (1999).

Hausen B M, Reichling L Harkeni'HAI. M: Degradation prod­ucts of monoterpenes are the sensitizing agent in tea tree oil. Am J Contact Dermatitis 10: 68-77 (1999).

Jandourek A, Vaishampayan J K, Vasques J A: Efficacy of mclaleuca oral solution for the treatment of fluconazole re­fractory oral candidiasis in AIDS patients. AIDS 12: 1033-1037 (1998).

Knight T E, Hansen B M: Melaleuca oil (tea tree oil) dermatitis. J Am Acad Dermatol 30: 423-427 (1994). MacDonald V: The rationale of treatment. Aust J Dent 34:281-285 (1930).

Mann C M, Cox S D, Markham J L: The outer membrane of Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749 contributes to its toler­ance to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Lett Appl Microbiol 30: 294-297 (2000).

Maudsley F, Kerr K G: Microbiological safety of essential oils used in complementary therapies and the activity of these compounds against bacterial and fungal pathogens. Support-Care Cancer 7:100-102 (1999).

May J, Chan C H, King A, Williams L, French G L: Time-kill studies of tea tree oils on clinical isolates. J Antimicrob Chemother 45: 639-643 (2000).

Moore W E C, Moore L V H: The bacteria of periodontal dis­eases. In: Socransky S S, & Haffajee A D (Eds): Periodontology 2000. Munksgaard,Copenhagen, pp. 66-77 (1994).

NCCLS: Methods for antimicrobial susceptibility testing for bacteria that grow aerobically; Approved Standard-Fourth Edition, NCCLS,Pennsylvania(1997a).

NCCLS: Methods for antimicrobial susceptibility testing of ana­erobic bacteria; Approved Standard-Fourth Edition, NCCLS,Pennsylvania(1997b).

Nenoff P, Haustein U-F, Brandt W: Antifungal activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) against pathogenic fungi in vitro. Skin Pharmacol 9: 388-294 (1996).

Raman A, Weir U, Bloomfield S F: Antimicrobial effects of tea-tree oil and its major components on Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis and Propionibacterium acnes. Lett Appl Microbiol 21: 242-245 (1995).

Selvaag E, Eriksen B, Thure P: Contact allergy due to tea tree oil and cross sensitisation to colophony. Contact Dermatitis 31: 124-125 (1994).

Shapiro S, Meier A, Guggenheim B: The antimicrobial activity of essential oils and essential oil components towards oral bacteria. Oral Microbiol Immunol 9: 202-208 (1994).

Slots J; Subgingival microflora and periodontal disease. J Clin Periodontal 6: 351-382 (1979).

Tong M M, Altman P M, Barnetson R S: Tea tree oil in the treatment of tinea pedis. Trop Med Int Health 4: 284-287 (1999).

Von Graevenitz A, Heitz M, Lothy R, Meyer J, Tosch W: Quan­titative Empfindlichkeitsbestimmungen fur Bakterien. Schweiz med. Wschr. 117: 509-517 (1987).

Walsh L J, Longstaff J: The antimicrobial effects of an essential oil on selected oral pathogens. Periodontology 8:11-15 (1987).

Научная статья                                              Australian Dental Journal 2004;49:2;78-83.

Влияние геля с маслом чайного дерева на зубной налет и хронический гингивит

S. Soukoulis,* R. Hirsch*

* Стоматологическая школа при университете Аделаиды.

Аннотация

Обоснование: В этом клиническом исследовании выполнялась оценка эффектов применяемого местно геля с маслом чайного дерева (МЧД) в отношении зубного налета и хронического гингивита.

Методы: В данном двойном слепом лонгитюдном, не перекрестном исследовании принимали участие 49 человек без других медицинских нарушений, (24 мужчины и 25 женщин) в возрасте от 18 до 60 лет, которые не курили и страдали тяжелым хроническим гингивитом. Участников случайным образом разделили (рандомизацией) на три группы, одна из которых лечилась гелем с МЧД (2,5%), другая – гелем с хлоргексидином (ХГД) (0,2%) и третья – плацебо. Исследуемые средства наносились зубной щеткой два раза в день. Терапевтические эффекты оценивались через четыре и восемь недель исследования при помощи десневого индекса (GI), индекса кровоточивости сосочков (PBI) и индекса зубного налета (PSS).

Результаты: Побочные реакции на все виды исследуемых гелей отсутствовали. Данные были разделены по подмножествам зубов (передние и жевательные) и зубным поверхностям (щечные и язычные). В группе МЧД было установлено достоверное снижение оценок PBI и GI. Однако оценки зубного налета показали, что МЧД не только не уменьшало отложения налета, но и способствовало его усилению в последние недели исследуемого периода.

Вывод: Хотя для более определенных выводов нужны дальнейшие исследования, результаты этой работы показали, что противовоспалительные свойства геля с МЧД, наносимого местно на воспаленные ткани десны, позволяют использовать его в качестве полезного нетоксичного средства, дополняющего химиотерапию периодонта.

Ключевые слова: эфирное масло, зубной налет, хронический гингивит.

Предисловие

         Масло чайного дерева (МЧД) получают из бумажнокорового дерева семейства миртовых (Myrtaceae). Обычно используются два рода - лептоспермум (Leptospermum) и мелалеука (Melaleuca). Аборигены Австралии использовали получаемые из этих деревьев лекарственные вещества, включая и МЧД, на протяжении нескольких десятков тысячелетий. Эти растительные препараты применялись внутренне и наружно для ослабления боли и укрепления здоровья.¹ МЧД аборигены использовали для лечения ссадин, порезов, простуды и гриппа. Сегодня МЧД во всем мире применяют в составе косметики, медицинских и стоматологических средств (так называемые «натуральные» зубные пасты). Вместе с тем, в литературе очень мало публикаций о влиянии МЧД на периодонт, и такие средства не проходили строгих процедур оценки, установленных федеральными органами для обычных медицинских средств.

         Основными активными ингредиентами МЧД являются 1,8-цинеол и терпинен-4-ол. Кроме того, масло содержит множество других компонентов с пока еще не изученными биологическими свойствами. Эти компоненты также обнаруживаются и в других широко применяемых эфирных маслах, в частности в эвкалиптовом и фенхельном масле. 1,8-цинеол обладает противовоспалительными свойствами,^2-4 и это вещество проникает через человеческую кожу.⁵Терпинен-4-ол оказывает сходные противовоспалительные действия^6,7, но дополнительно обладает бактерицидной активностью.^8-12

Несмотря на совершенно другие механизмы действия, диапазон противомикробной активности МЧд примерно такой же, как и у хлоргексидина (ХГД).^9,12-18 Оба эти вещества проявляют бактерицидные, противовирусные и противогрибковые свойства. Поэтому МЧД представляется многообещающим средством для лечения хронического гингивита и периодонтита, которые, как известно, имеют бактериальный и воспалительный компоненты.

Задачей данного исследования было изучение в неконтролируемых условиях лечебного эффекта геля с МЧД, наносимого два раза в день на воспаленные участки десны, и оценка количества зубного налета у испытуемых с нелеченным ранее периодонтом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Это исследование получило разрешение комитета по этике исследований на людях Аделаидского университета. Все участники предоставили подписанные формы информированного согласия на участие в исследовании. Для участия отбирались не страдающие курением лица мужского и женского пола в возрасте от 18 до 60 лет с зубным налетом и гингивитом средней или серьезной тяжести (оценка GI 2-3 не менее одного зуба в каждом квадранте). Необходимыми условиями участия в исследовании было наличие не менее 20 собственных зубов, отсутствие диабета, заболеваний почек и печени, ревматоидного артрита, беременности и лактации, а также известной аллергии на МЧД и предшествующего лечения периодонта в последние шесть месяцев. Среди прочих критериев исключения были: прием стероидов, нестероидных противовоспалительных средств, дилантина или антибиотиков длительностью более семи дней в последние шесть месяцев, а также стоматологическая антибиотикотерапия.  

         Исследование проводилось по двойной, слепой, лонгитюдной, не перекрестной схеме с тремя группами участников. Одна группа, экспериментальная, применяла МЧД (гель с 2,5% МЧД). Вторая группа положительного контроля лечилась ХГД (гель с 0,2% хлоргексидина, Периогард/Periogard, Колгейт, шт. Новый Южный Уэльс, Австралия) и третья группа отрицательного контроля использовала плацебо (гель по виду и запаху идентичен активным препаратам, но без МЧД). Продолжительность исследования составляла восемь недель с оценкой в контрольные моменты через 0, 4 и 8 недель лечения. Оценка выполнялась при помощи десневого индекса (GI),¹⁹ индекса сосочкового кровотечения (PBI) и оценки поверхностного зубного налета (PSS). Система оценки зубного налета (PSS) представляла собой модификацию индекса зубного налета Турески (Turesky),²⁰ определяемого нанесением на зуб проявляющего раствора с эритрозином 1% (масс./вес.) (Дисклогель/Disclogel, Колгейт, шт. Новый Южный Уэльс, Австралия).

Таблица 1. Распределение участников по возрасту и полу

ДИ = доверительный интервал.

         Во время первого визита всех участников исследования инструктировали наносить гель по всей длине щетины предоставляемой зубной щетки. Также участникам раздавались двухстраничные буклеты с подробными инструкциями о нанесении геля. Гелем следовало пользоваться как зубной пастой, т.е. два раза в день требовался контакт не менее двух минут с прилегающими к зубу тканями десны. На протяжении 30 минут после нанесения геля запрещалось полоскать рот, есть и пить. Кроме того, участников просили на протяжении всего периода исследования не пользоваться патентованными зубными пастами, ополаскивателями рта или другими чистящими средствами. Участникам случайным образом назначался один из трех гелей. Ни участники, ни исследователи до окончания исследования не знали состава геля.

         Для определения субъективной погрешности, вносимой исследователями, было выполнено дополнительное обследование пятерых участников в возрасте от 26 до 63 лет с измерением GI, PBI и PSS четырех участков вокруг каждого зуба (один день между исследованиями). В дальнейшем применялись аналогичные процедуры обследования.

Анализ данных

         Статистические анализы данных выполнялись при помощи компьютерного программного обеспечения (SPSS, версия 10.05, Чикаго, США). Статистические отличия средних значений исследуемых групп определялись при помощи критериев дисперсионного анализа. Статистически достоверные вариации средних значений каждой группы определялись при помощи критерия Шеффе. Достоверность изменений в каждой группе между периодами времени 0-4, 4-8 и 0-8 недель устанавливалась при помощи парных t-критериев. Данные каждого отдельного субъекта суммировались, усреднялись и взвешивались в зависимости от количества исследованных зубов этого испытуемого.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Профиль исследуемой популяции

Для исследования было отобрано пятьдесят восемь человек. Из них девять не закончили исследование и их данные в конечных анализах не использовались. Среди оставшихся 49 участников было 25 мужчин и 24 женщины. В таблице 1 представлено распределение этих участников по возрасту и полу, которое показывает отсутствие статистически достоверных отличий между группами (критерий хи-квадрат Пирсона соответственно p=0.772 и p=0.889).

Статистический анализ показал приемлемые границы субъективной погрешности, вносимой исследователями.

Побочные реакции ни на один из применяемых гелей не сообщались. Между тремя группами было обнаружено несколько достоверных отличий динамики средних оценок GI, PSS и PBI. После включения в анализ данных всех зубов и поверхностей оказалось, что большинство изменений во всех трех группах произошли в первые четыре недели исследования. После разделения данных по передним/жевательным зубам и щечной/язычной поверхности критерии дисперсионного анализа PBI обнаружили в группе геля с МЧД статистически достоверные отличия средних значений относительно положительных и отрицательных контролей (совокупности данных щечной поверхности и передних зубов). Критерии дисперсионного анализа также применялись для выявления отличий улучшений между группами, т.е. для сравнения минимальных оценок на четвертой и восьмой неделе с полученными вначале исследования значениями (данные PBI, GI и PSS). На рисунках 1 и 2 в графической форме представлены общие результаты PBI и GI.

Совокупность данных всех зубов и поверхностей (общий набор данных), совокупность щечной поверхности и совокупности данных передних и жевательных зубов показали наибольшее количество улучшений оценок PBI в группе МЧД. Все совокупности данных, за исключением одной (совокупность данных передних зубов), были статистически достоверными. Максимальное улучшение оценок PBI было установлено для данных щечной поверхности. Наибольшее число временных периодов с максимальными улучшениями (9) было в группе МЧД. В группе ХГД было 4 таких периода, а в группе плацебо лишь 1.

Группа ХГД отличалась наибольшим количеством временных периодов с максимальными улучшениями оценки GI (7), затем по этому критерию шла группа МЧД (6) и замыкала тройку группа плацебо (5). В группе МЧД было максимальное количество участков с улучшением GI. В общем, отличия между группами были незначительные, о чем свидетельствовало отсутствие статистической достоверности.

Статистически достоверные отличия оценок PSS разных групп отсутствовали. В группе МЧД во все временные периоды постоянно отмечалось наименьшее количество участков с улучшениями. Наиболее выраженные по сравнению с другими группами улучшения PSS были в группе ХГД. Например, в группе ХГД было большее количество временных периодов с максимальными улучшениями (11), чем в группе плацебо (4) или МЧД (1).

Средние изменения в группах

         Парные t-критерии показали статистически достоверные изменения оценок GI и PBI (см. рисунок 1 и 2). Большинство этих достоверных отличий было в группах МЧД и ХГД. Парные t-критерии подтвердили, что использование геля с МЧД связано с наиболее выраженными изменениями PBI во всех совокупностях данных временных периодов 0-4 и 0-8 неделя. Такие изменения были установлены для 10 из 15 временных периодов (пять совокупностей данных трех временных периодов 0-4, 4-8 и 0-8 неделя). За исключением данных язычной поверхности, все эти результаты были статистически достоверными. В группе геля с ХГД было пять временных периодов с максимальными изменениями, но все без статистической достоверности отличий (рис. 1). Для группы ХГД было установлено максимальное изменение GI в большинстве совокупностей данных (восемь временных периодов) со статистически достоверными результатами для семи периодов. В группе МЧД было шесть временных периодов с максимальными изменениями, и достоверные результаты были получены для пяти из них (рисунок 1).

         По PSS достоверные отличия отсутствовали. Вместе с тем, только в группе МЧД наблюдалось увеличение оценки отложений зубного налета в периоды 0-4 и 0-8 неделя. Наибольшее снижение оценки зубного налета в большинстве совокупностей данных было установлено для группы ХГД (7), затем шла группа плацебо (6) и замыкала ряд группа МЧД (1).

Рисунок 1. Средние изменения PBI в общей совокупностях данных всех зубов, совокупностях данных щечной/язычной поверхности и передних/жевательных зубов.

ОБСУЖДЕНИЕ

         С учетом присущих этой работе ограничений, полученные результаты показали, что гель с МЧД ослабляет воспаление десны эффективнее, чем положительный или отрицательный контроль. Интересно, что улучшение оценки PBI в группе МЧД не сопровождалось снижением оценок образования зубного налета.

Хотя средние благотворные изменения в группе МЧД не превышали одной единицы, этот эффект достигался в нескольких совокупностях данных. Например, полученное для щечных поверхностей среднее значение 0,75 (среднее изменение за период 0-4 неделя) в три раза превышало значение группы ХГД (0,26) и в два раза показатель группы плацебо (0,33). Доверительные интервалы 95% для щечных поверхностей показывали изменение на одну единицы (диапазон 0,49-1,01), что свидетельствовало о клинически выраженных изменениях на щечных поверхностях в группе МЧД.

         В группе МЧД наибольшее число участков с улучшениями было обнаружено в следующих совокупностях данных: общая совокупность всех зубов, совокупность жевательных зубов, передних зубов и щечных поверхностей. Для периода 0-4 неделя улучшения во всех совокупностях данных (за исключением передних зубов) были статистически достоверными. Наиболее выраженное улучшение оценок PBI было получено для щечных поверхностей. Наблюдаемые улучшения PBI свидетельствовали, что МЧД ослабляло гингивит в большей степени, чем другие исследуемые средства.

Критерии дисперсионного анализа не обнаружили достоверных отличий средних групповых значений и средних изменений, т.е. реакции в зависимости от анализируемой совокупности данных были или примерно одинаковыми, или слабовыраженными. Результаты примерно совпадали с полученными в других исследованиях гелей с ХГД,^21-23 хотя авторы тех работ сообщали бóльшие изменения, чем наблюдаемые в нашем исследовании. Возможным объяснением этого является тот факт, что к участию в исследовании допускались люди с зубным камнем, который перед исследованием удалялся. Поэтому не исключено, что сообщаемые изменения отражали комбинированный эффект механической чистки и действия геля с ХГД.

Основной вывод нашего исследования в том, что снижение оценок PBI и GI в группах МЧД и ХГД указывает на клинически выраженный терапевтический эффект даже несмотря на, в общем-то, неудовлетворительную гигиену ротовой полости и наличие у участников на протяжении всего исследования зубного камня и значительного налета под и над десной.

Рисунок 2. Изменения оценок GI в общей совокупности данных всех зубов, в совокупности данных щечной/язычной поверхности и передних/жевательных зубов. (Значком  отмечены статистически достоверные отличия внутри групп между временными периодами 0-4, 4-8 и 0-8 неделя).

         Пока нет «золотого стандарта» оценки тяжести гингивита, лечебных эффектов различных препаратов и терапевтических методик. Поскольку в исследованиях различных средств гигиены ротовой полости часто применяется GI, мы также его использовали для возможности сравнения с результатами других авторов. Вместе с тем, GI присущи существенные ограничения, которым в соответствующей литературе почему-то уделяется мало внимания. Так, GI имеет меньше оценочных критериев, чем PBI; следовательно, по сравнению с PBI он менее информативный и менее чувствительный к слабым изменениям воспаления десны. Также стоит отметить, что GI был выработан на заре развития периодонтологии. В то время считалось, что развитию BOP предшествует изменение окраски тканей десны, хотя дальнейшие исследования опровергли это предположение.^24,25 Изменение окраски десны не всегда является индикатором воспаления десневой ткани, поскольку на начальном этапе развития воспалительного поражения ВОР может присутствовать и без внешних изменений окраски. Кроме того, при использовании в качестве индикатора состояния периодонта изменений окраски десны на точность оценки могут влиять такие смешивающие факторы, как слизисто-кожные поражения десны (эрозивный красный плоский лишай, пемфигус и т.д.)

         При продлении данного исследования оправдано добавление клинической оценки воспаления десны, которая бы позволила повысить объективность. Это может быть оценка по температуре придесневого кармана²⁶ или же измерение уровня цитокинов (например, ИЛ-1, ИЛ- 6, ИЛ-8).²⁷

Полученная в нашем и в некоторых других исследованиях информация показывает, что мощный in vitro бактерицидный эффект МЧД в условиях in vivo не транслируется на ослабление образования зубного налета. Отмечались слабые изменения PSS, в том числе и в группе ХГД, но эти изменения не были статистически достоверными. Пока опубликовано лишь два исследования, в которых in vivo оценивались эффекты МЧД в отношении бактериальной флоры ротовой полости и образования зубного налета. Наблюдаемая в нашем исследовании реакция PSS в группе МЧД была примерно такой же, как и в других работах исследовавших МЧД в качестве бактерицидного средства для ротовой полости.²⁸ Однако прямое сравнение результатов этих работ невозможно по причине отличий протоколов исследований и применяемых форм МЧД (гель и ополаскиватели рта). Так, опоскиватели рта с МЧД эффективно снижали численность бактерий в слюне примерно на полчаса. Снижение было примерно такое же, как и после используемого в качестве контроля ХГД, однако через шесть часов после применения МЧД уровни бактерий в слюне возвращались в норму, а бактерицидный эффект ХГД сохранялся.

Аналогичные результаты наблюдались в клиническом испытании ополаскивателя рта с МЧД²⁸. Это исследование проводилось по перекрестному протоколу с перерывом в три дня при участии восьми человек. После четырех дней полного отсутствия гигиены рта на протяжении недели выполнялись ополаскивания простой водой. Следующую неделю применялся ополаскиватель с ХГД и в последнюю неделю ополаскиватель с МЧД. Оценка налета выполнялась по площади и индексу зубного налета, а количество колоний жизнеспособных бактерий подсчитывалось при помощи флуоресценции. Ополаскиватель с МЧД не оказывал слияния на количество и качество наддесневого налета.

Полученные в этом исследовании изменения оценок налета в группе ХГД были статистически недостоверны. Однако, средние изменения в группе ХГД были наибольшими по сравнению с другими группами.

Клинические исследования гелей с ХГД показали совсем другие результаты, хотя клинические действия геля с ХГД в отношении зубного налета сильно зависели от частоты применения, используемой концентрации и предварительной обработки зубов участников вначале исследования, что существенно затрудняет сравнение данных разных исследований.^21-23,29,30 Согласно представленным результатам большинство терапевтических эффектов проявилось в первый период наблюдения (0-4 неделя). Возможно, это следствие ослабления точности соблюдения участниками предписанной схемы лечения на поздних этапах исследования, или же достижения конечной точки лечебных эффектов, т.е. после достижения плато дальнейшие улучшения клинических параметров просто невозможны.^21,22 Не исключено, что ограниченные изменения оценок PSS, особенно в группе ХГД, обусловлены неудовлетворительным соблюдением схемы лечения. Косвенным индикатором точности соблюдения предписанного лечения является время, затрачиваемое участниками на нанесение геля на протяжении четырех недель. Вместе с тем, имели место существенные отличия количеств используемого геля. Так, большинство участников сообщили, что количества выданного геля хватило на четыре недели и немного осталось. Но некоторые участники заявляли о достаточно больших остатках геля. Возможно, эти участники ненадлежащим образом соблюдали предписанную схему нанесения средства. В этом исследовании участвовали люди с отложениями зубного налета и с под- наддесневым камнем, что затрудняло эффективную гигиену рта и, возможно, способствовало увеличению зубного налета. Применение проявляющего раствора при значительном зубном камне на зубах не эффективно, поскольку окрашивание происходит независимо от отложений зубного налета, и эта недостоверность вносит погрешность во все групповые измерения.

Возможные периодонтальные применения геля с МЧД

         Поскольку у участников группы применения МЧД воспаление снижалось без сопутствующего устранения зубного налета, это заставляет предположить противовоспалительный, но не антибактериальный механизм действия. Известны определенные компоненты МЧД, которые в условиях in vitro и in vivo ослабляли воспаление.^2,3,6,7 Например, у испытуемых, которые пользовались препаратом Соледум (Soledum®, содержит 1,8-цинеол), отмечалось достоверное снижение производства LBT₄ и PGE₂ в изолированных моноцитах.² 1,8-цинеол также вызывал достоверное торможение производства цитокинов in vitro (α-фактор некроза опухоли, ИЛ-1b) LPS-стимулированными моноцитами.³ Аналогичные in vitro эффекты в моноцитах демонстрировал и терпинен-4-ол.^6,7            Известны липофильные свойства некоторых компонентов МЧД, что облегчает их диффузию через эпителий.⁵ Таким образом, если МЧД действительно легко всасывается в десневую ткань после местного нанесения, и после попадания в соединительную ткань проявляет там противовоспалительное действие, то это уникальное нетоксичное средство является полезным дополнением существующих схем химиотерапии периодонта.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Barr A, Chapman J, Smith N, Beveridge M. Traditional bush medicines – An Aboriginal pharmacopoeia.Victoria: Greenhouse Publications, 1988.

2. Juergens UR, Stober M, Schmidt-Schilling L, Kleuver T, Vetter H. Antiinflammatory effects of eucalyptol (1.8-cineole) in bronchial asthma: inhibition of arachidonic acid metabolism in human blood monocytes ex vivo. Eur J Med Res 1998;3:407-412.

3. Juergens UR, Stober M, Vetter H. Inhibition of cytokine production and arachidonic acid metabolism by eucalyptol (1.8- cineole) in human blood monocytes in vitro. Eur J Med Res 1998;3:508-510.

4.SantosFA, Rao VS. Antiinflammatory and antinociceptive effects of 1,8-cineole a terpenoid oxide present in many plant essential oils. Phytother Res 2000;14:240-244.

5. Williams AC, Barry BW. Terpenes and the lipid-proteinpartitioning theory of skin penetration enhancement. Pharm Res 1991;8:17-24.

6. Hart PH, Brand C,CarsonCF, Riley TV, Prager RH, Finlay-Jones JJ. Terpinen-4-ol, the main component of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil), suppresses inflammatory mediator production by activated human monocytes. Inflamm Res 2000;49:619-626.

7. Brand C, Ferrante A, Prager RH, et al. The water soluble components of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) suppress the production of superoxide by human monocytes, but not neutrophils, activated in vitro. Inflamm Res 2001;50:213-219.

8.CarsonCF, Cookson BD, Farrelly HD, Riley TV. Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Antimicrob Chemother 1995;35:421- 424.

9.CarsonCF, Riley TV. Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Appl Bacteriol 1995;78:264-269.

10. Hammer KA,CarsonCF, Riley TV. In vitro susceptibility of Malassezia furfur to the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Med Vet Mycol 1997;35:375-377.

11. Hammer KA,Carson, CF, Riley TV. In-vitro activity of essential oils, in particular Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and tea tree oil products, against Candida spp. J Antimicrob Chemother 1998;42:591-595.

12. May J, Chan CH, King A, Williams L, French GL. Time-kill studies of tea tree oils on clinical isolates. J Antimicrob Chemother 2000;45:639-643.

13. Moran J, Addy M, Newcombe R. A clinical trial to assess the efficacy of sanguinarine-zinc mouthrinse (Veadent) compared with chlorhexidine mouthrinse (Corsodyl). J Clin Periodontol 1988;15:612-616.

14. Ostela I, Tenovuo J. Antibacterial activity of dental gels containing combinations of amine fluoride, stannous fluoride, and chlorhexidine against cariogenic bacteria. Scand J Dent Res 1990;98:1-7.

15. Shapiro S, Meier A, Guggenheim B. The antimicrobial activity of essential oils and essential oil components towards oral bacteria. Oral Microbiol Immunol 1994;9:202-208.

16. Cox SD, Gustafson JE, Mann CM, et al. Tea tree oil causes K+ leakage and inhibits respiration in Escherichia coli. Lett Appl Microbiol 1998;26:355-358.

17.CoxSD, Mann CM,MarkhamJ, et al. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol 2000;88:170-176.

18. Fine DH, Furgang D, Barnett ML, Drew C, Steinberg L, Charles CH, Vincent JW. Effect of an essential oil-containing antiseptic mouthrinse on plaque and salivary Streptococcus mutans levels. J Clin Periodontol 2000;27:157-161.

19. Loe H. The Gingival Index, the Plaque Index and the Retention Index Systems. J Periodontol 1967;38:610-616.

20. Fischman SL. Current status of indices of plaque. J Clin Periodontol 1986;13:371-374.

21. Hoyos DF, Murray JJ, Shaw L. The effect of chlorhexidine gel on plaque and gingivitis in children. Br Dent J 1977;142:366-369.

22. Joyston-Bechal S, Smales FC, Duckworth R. Effect of metronidazole on chronic periodontal disease in subjects using a topically applied chlorhexidine gel. J Clin Periodontol 1984;11:53-62.

23. Lie T, Enersen M. Effects of chlorhexidine gel in a group of maintenance-care patients with poor oral hygiene. J Periodontol 1986;57:364-369.

24. Meitner SW, Zander HA, Iker HP, Polson AM. Identification of inflamed gingival surfaces. J Clin Periodontol 1979;6:93-97.

25. Hirsch RS, Clarke NG, Townsend GC. The effect of locally released oxygen on the development of plaque and gingivitis in man. J Clin Periodontol 1981;8:21-28.

26. Wolff LF, Koller NJ, Smith QT, Mathur A, Aeppli D. Subgingival temperature: relation to gingival crevicular fluid enzymes, cytokines, and subgingival plaque micro-organisms. J Clin Periodontol 1997;24:900-906.

27. McGee JM, Tucci MA, Edmundson TP, Serio CL, Johnson RB. The relationship between concentrations of proinflammatory cytokines within gingiva and the adjacent sulcular depth. J Periodontol 1998;69:865-871.

28. Arweiler NB, Donos N, Netuschil L, Reich E, Sculean A. Clinical and antibacterial effect of tea tree oil – a pilot study. Clin Oral Investig 2000;4:70-73.

29. Hansen F, Gjermo P, Eriksen HM. The effect of a chlorhexidine containing gel on oral cleanliness and gingival health in young adults. J Clin Periodontol 1975;2:153-159.

30. Lennon MA, Davies RM. A short-term evaluation of a chlorhexidine gel on plaque deposits and gingival status. Pharmacol Ther Dent 1975;2:13-19.

Доклад Томаса Имфельда и Беатрис Зенер:

Действие геля с фторидом олова на дентин

Поглощение дентином и растворимость человеческого дентина в кислоте после обработки in vitro различными гелями с фторидом олова

Клиника профилактической стоматологии и кариологии, Центр исследования зубов, ротовой полости и челюсти при Цюрихском университете

Научная часть Швейцарского стоматологического ежемесячника

 Том 2: 2/1997

Действие геля на основе фторида олова на дентин

Поглощение дентином и растворимость человеческого дентина в кислоте после обработки in vitro различными гелями с фторидом олова

Томас Имфельд и Беатрис Зенер

Клиника профилактической стоматологии, пародонтологии и кариологии, Центр исследования зубов, ротовой полости и челюсти при Цюрихском университете

Резюме

         Была подтверждена эффективность применения геля с фторидом олова в качестве локального источника фтора для профилактики кариеса и гингивита, а также для лечения гиперчувствительности зубов. Поскольку стабилизация фторида олова (II) в форме геля является сложной фармацевтической задачей, это соединение фтора в составе средств местного применения практически не встречается. В Швейцарии разработан новый гель на основе фторида олова (EmolfluorÒ), который благодаря применению специального стабилизатора, препятствующего преобразованию олова (II) в олово (IV), должен обладать приемлемой стабильностью. В настоящем исследовании сравнивались поглощение фтора и растворимость в кислоте поверхности дентина после обработки in vitro двумя свежеприготовленными гелями фторида олова, новым промышленным гелем, гелем с фторидом олова, реализуемым на американском рынке, и водяным контролем. Свежеприготовленный гель на основе фторида олова (II) лучше всего снижал растворимость дентина в кислоте, за ним следовал новый гель и свежеприготовленный гель на основе фторида олова (IV). Новый гель оказался значительно лучше, чем американский гель с фторидом олова и водяной контроль, которые вообще не оказывали защитного действия.

Acta Med Dent Helv 2: 17-22 (1997).

Ключевые слова: локальная флюоризация, фторид олова, локальное подавление деминерализации

Принято к публикации: 27 октября 1996 года

Адрес для контактов:

Проф. д-р мед. Т. Имфельд, клиника профилактической стоматологии, пародонтологии и кариологии, Центр исследования зубов, ротовой полости и челюсти, Цюрихский университет, Платтенштрассе 11, 8028, Цюрих, Тел. 01/257 33 11, факс 01/262 01 05.

Введение

Кариостатическое действие фторида базируется на нескольких различных механизмах. Раньше наиболее важным считалось поглощение веществом зуба фторида в форме фторапатита. Но, как стало известно, фторапаратит обладает меньшим кариостатическим потенциалом, чем фторид, растворенный в веществе зуба. Фторид может или адсорбироваться в виде кристаллов апатита, или осаждаться на поверхности зубов как рН-регулируемый резервуар фторида в виде слоя фторида кальция (с примесями). Обзор современной литературы по этой теме был опубликован Фишером и соавт. (1995).

Первым фторидным соединением, которое начали добавлять в зубные пасты в США, был фторид олова (SnF₂). Публикации о первых клинических исследованиях таких паст появились в 50-е годы (Мюллер и Радике 1957, Мюллер, 1958). Несмотря на доказанное кариостатическое действие SnF₂ фармакологические проблемы стабилизации олова в составе зубных паст быстро привели к применению других соединений фторида, в частности, NaF, MFP и AmF. Поэтому основная заслуга во впечатляющей победе за последние тридцать лет над кариесом коронковой части зуба в промышленно развитых странах принадлежит именно зубным пастам с этими соединениями фторида (Рёлла и соавт. 1991). Благодаря этому успеху профилактической медицины сегодня людям удается сохранить больше своих зубов до глубокой старости. Но значительное распространение гингивитов показывает, что механическое действие фторида на образование зубного налета явно меньше, чем его химическое кариостатическое действие (Ланг, 1990). К тому же распространение гингивальных рецессий повышает риск корневого кариеса и гиперчувствительности шейки зуба в среднем возрасте. Эти новые вызовы требуют терапевтических средств местного действия, способных бороться с кариесом эмали/дентина и с гингивитом, а также ослаблять гиперчувствительность шейки зуба. Именно этим объясняется возобновление интереса к фториду олова. Как и другие фторидные соединения SnF₂ противодействует кариесу коронковой части зуба. Но его воздействие на метаболизм зубного налета больше, чем у NaF, хотя место воздействия при гликолизе пока не определено (Тинанофф, 1995). Кроме того, SnF₂препятствует слипанию бактериальных клеток и их налипанию на поверхность зуба (Тинанофф и соавт. 1976, ОТА и соавт. 1989, КАМБАРА и НОРДЕ 1995). К тому же документально подтверждена  клиническая эффективность SnF₂ в форме безводного геля для контроля гингивитов (БОЙД, 1994, Тинанофф и соавт. 1989, Тинанофф 1995) (Обзор). В конечном итоге SnF₂вступает в реакцию с поверхностью дентина (РЁЛЛА и ЭЛЛИНГСЕН 1994) и ослабляет гиперчувствительность шейки зуба, закрывая канальцы дентина (ТРАШ и соавт. 1994, ЭЛЛИНГСЕН и РЁЛЛА 1987)

Такие гели поступают в продажу с 60-х годов прошлого века с галеновой формой фторида для местного нанесения. Они предлагаются как для профессиональной флюоризации зубов, так и для индивидуального использования на дому. Предлагаемые в Швейцарии фторидные гели содержат фторид натрия (Binaco), аминфторид (Elmex), фторид олова (Resistan) или смеси этих солей фтора (Meridol). Продукты с NaF и AmF обычно содержат 12500 ч/млн F, а продукты с SnF₂– примерно 1000 ч/млн F. Основная трудность применения фторида олова в том, что двухвалентный фторид олова (II) в геле требует стабилизации для предупреждения гидролиза и окисления, без сопутствующего снижения его биоусвояемости. Фирма Dr.Wild и Со АГ, Базель разработала новый гель с фторидом олова (II), который благодаря соответствующей стабилизации органической эфирной кислотой должен обладать приемлемой стабильностью без преобразованию олова (II) в олово (IV) на протяжении длительного срока хранения. Целью настоящей работы является исследование in vitro поглощения олова дентином человеческого зуба и повышение устойчивости дентина к кислотам после нанесения этого и других гелей с фторидом олова.

Материалы и методы

Исследуемые продукты:

Использовались следующие продукты с фторидом олова:

-       Гель на основе фторида олова (II), 1000 ч/млн F и 3123 ч/млн Sn* (положительный контроль).

-       Гель на основе фторида олова (IV), 2000 ч/млн F и 3123 ч/млн Sn*, фирмы Dr.Wild, партия № 593012 (EmofluorÒ).

-       Гель-КАМÒ, партия № 411015 (Колгейт)**

Контроль – вода (отрицательный контроль)

Анализ исследуемых продуктов:

Перед исследованием в лаборатории определялся показатель рН, степень кислотности, содержание F  и Sn (II) в применяемых гелях (йодометрическим способом).

Дентиновый материал

Для исследования бралось 80 удаленных корней человеческих зубов (премоляры). Их поверхность очищалась стоматологическим инструментом для удаления зубного камня (скалером) и корни до исследования хранились в 0,1% растворе тимола при температуре 4 °С, чтобы не допустить обсеменения бактериями/грибками и высушивания. После этого корни зубов случайным образом разделили на несколько групп (всего 50 корней): по 10 корней для обработки 4 исследуемыми активными продуктами и еще 10 для обработки водяным контролем при определении растворимости в кислоте. Для определения поглощения олова тканью зуба бралось еще по 6 корней (всего 30) для обработки 4 тестируемыми продуктами и еще 6 для обработки водяным контролем.  

Обработка:

Дентиновые образцы по 2 раза в день обрабатывали исследуемыми продуктами в течение 5 дней подряд (всего 10 нанесений). Для этого их на 2 минуты укладывали в соответствующий гель и кисточкой надежно смачивали поверхность. После 2-минутного воздействия образцы дентина промывали дистиллированной водой, и затем 30 минут выдерживали под проточной        (5 л/час) деионизированной водой. Между отдельными нанесениями исследуемого геля образцы дентина хранились во влажностной камере.

Определение устойчивости к кислоте

Устойчивость к кислоте обработанных образцов дентина определялась при помощи кислотного травления (собственная модификация методики Гроблера с соавт. 1990). Точно ограниченные круглые участки дентина (диаметр 5 мм) 5 минут протравливали 120 мкл молочной кислоты с рН 3. Этот процесс повторялся 6 раз для оценки 6 слоев. В собранные пипеткой после травления 120 мкл молочной кислоты добавляли 1,7 мл 0,75% хлорида стронция для маскирования фосфора, после чего доливали дистиллированную воду до 5 мл. Содержание кальция в использованной при травлении молочной кислоте (растворенного из дентина) измерялось атомно-абсорбционным спектрометром (Perkin Elmer 2380) на длине волны 422,7 нм. Результаты сообщались в мкг кальция в каждом слое и на исследованной поверхности (19,6 мм²).

Определение поглощения олова:

Поглощение олова после обработки исследуемыми гелями определялось с помощью электронного микрозонда (Система EDX, REM 926, Цейс). Для этого образцы дентина в течение трех недель высушивались в эксикаторе с кизельгелем синим с последующим распылением углерода. Результаты сообщались в весовых % олова, кальция и фосфора на поверхности.

Результаты

Анализ использованных гелей:

Полученные значения приведены в таблице 1.

Таблица 1. Анализ использованных гелей.

* Свежеприготовленный препарат (3123 ч/млн Sn).

Кислотность указывается количеством мл 0,1 Н раствора едкого натра/100 г геля, израсходованного при титровании до эквивалентной точки.

Растворимость в кислоте после обработки исследуемым гелем:

На рисунке 1 показана устойчивость к кислоте образцов дентина после нанесения сравниваемых гелей, выраженная значениями содержания кальция (мкг Са) в 6 протравленных слоях дентина. Достоверность различий растворимости в кислоте в каждом слое после обработки различными исследуемыми гелями или водой устанавливалась при помощи критериев Фишер PLSD или F-критерия Шеффе. Обработанные гелем фирмы д-р Вильд образцы дентина во всех шести слоях были значительно более устойчивы к кислоте, чем образцы, обработанные гелем КАМ или водяным контролем. Гель КАМ по сравнению с водой существенно снижал растворимость в кислоте только в первых двух слоях. Свежеприготовленные гели с оловом (II) и оловом (IV) в данном исследовании были наиболее эффективные, но в галеновой форме они нестабильны и поэтому непригодны для средств индивидуальной гигиены рта.

Определение содержания олова, кальция и фосфора на поверхности дентина

Содержание олова на поверхности дентина после обработки различными гелями (производилось по 3 измерения в каждой группе из 6 корней) показано на рисунке 2. По содержанию олова имели место достоверные различия (критерии Фишера PLSD или F-критерий Шеффе) между следующими средствами: всеми гелями и водяным контролем, гелем с оловом (II) и гелем КАМ, гелем с оловом (II) и гелем фирмы д-р Вильд, гелем с оловом (II) и гелем с оловом (IV). Различий между гелем КАМ и гелем фирмы д-р Вильд не было.

         Содержание кальция на поверхности дентина после обработки различными гелями показано на рисунке 3. По содержанию кальция достоверные различия были обнаружены между: всеми гелями и водяным контролем, гелем КАМ и гелем с оловом (II) и (IV), гелем фирмы д-р Вильд и гелями с оловом (II) и (IV). Различий между гелем КАМ и гелем фирмы д-р Вильд не было.

Содержание фосфора на поверхности дентина после обработки различными гелями показано на рисунке 4. По содержанию олова достоверные различия имелись между: всеми гелями и водяным контролем, гелем КАМ и гелем с оловом (II) и (IV), гелем фирмы д-р Вильд и гелем с оловом (II), гелем с оловом (II) и с оловом (IV). Различий между гелем КАМ и гелем фирмы д-р Вильд не было.

Рис. 1. Растворимость в кислоте после обработки исследуемыми гелями и водяным контролем, выраженная в мкг растворенного кальция в каждом протравливаемом слое.

Рис. 2. Содержание олова на поверхности дентина после обработки исследуемыми продуктами и водяным контролем.

Рис. 3. Содержание кальция на поверхности дентина после обработки исследуемыми гелями и водяным контролем.

Рис. 4 .Содержание фосфора на поверхности дентина после обработки исследуемыми гелями и водяным контролем.

Обсуждение

         Уменьшение растворимости в кислоте является мерой воздействия фторида олова на дентин, которое требуется от продуктов с SnF₂. Различные исследования in vitro изучали реакцию SnF₂ с дентином или гидроксилапатитом (Вай и Форбес, 1969, Джордан и соавт. 1971, Геррити и Джордан 1977, Бабкок и соавт. 1978, Пурделл-Левис и соавт. 1979, Эллинсен и Рёлла, 1987, Адди и Мостафа, 1988, Мюллер и соавт. 1994). Исследования, включавшие растровое электронное микроскопирование (Эллинсен и Рёлла, 1987, Адди и Мостафа , 1988, Мюллер и соавт. 1994) показали, что в результате реакции SnF₂с поверхностью дентина образуются отложения, что приводит к закупорке дентинных канальцев. МЮЛЛЕР и соавт. (1994) исследовали in vitro и in situ действия нанесения на дентиновые образцы безводного 0,4% геля на основе фторида олова. Снимки, сделанные растровым электронным микроскопом после обоих видов нанесения, показали отложения толщиной 2-3 мкм, которые закрывали дентинные канальцы. Анализ микрозондом EDX подтвердил наличие олова в канальцах на глубине до 100 мкм. Электоронно-спектроскопический анализ не позволил получить точное химическое описание этих отложений, но показал, что оловом образует комплексы с такими ранее описанными (Дональдсон, 1967, Мартелль, 1964) лигандами, как кислород, фторид, гидроксид и фосфаты. Вероятно, образуется окись или гидроокись олова (SnO_N или Sn(OH)_N, причем N = 2,1 – 2,3) и гидроксифосфат олова (Sn₂OHPO₄). Содержание олова в глубине увеличивалось и достигало 6-7% олова. Обнаружение Мюллером с соавт. (1994) большего количества олова и меньшего количества фторида в отложениях на дентиновых образцах подтверждает предшествующие исследования in vitro, в которых дентин обрабатывался свежеприготовленным слабым (£ 1%) раствором SnF₂(Эллингсен и РЁЛЛА 1987, АДДИ и МОСТАФА, 1988, Доуэлл и Адди 1984, Эллингсен 1986). Очевидно, что олово является главным фактором образования отложений, а фторид участвует в реакции с Sn (II) как второй участник реакции. Этот вывод совпадает с результатами Адди и Мостафа 1988, которые обнаружили закупорку дентинных канальцев после обработки растворами фторида или хлорида олова, но не нанесения фторида или монофторофосфата натрия. Наряду с известным эффектом уменьшения гиперчувствительности шейки зуба – вероятно, за счет ослабления или преобразования движения жидкости в канальцах, эта закупорка канальцев дополнительно обеспечивает защиту от действия кислот. Последнее обстоятельство, с одной стороны, оказывает профилактическое действие против корневого кариеса, а с другой, – ослабляет разъедание поверхности и размягчение оголенной шейки зуба кислотами пищи. Таким образом, достигается другая важная цель лечения, а именно, замедляется развитие или прогрессирование клиновидных дефектов при механических воздействиях на уже поврежденную поверхность дентина средств гигиены полости рта.

Изучение растворимости в кислоте после обработки различными гелями показало, что наиболее эффективен свежий гель на основе олова (II), далее в порядке снижения эффективности следовали  гель фирмы д-р Вильд и свежий гель с оловом (IV). Действие геля КАМ было значительно меньшим. Растворимость в кислоте после обработки гелем КАМ существенно отличалась от водяного контроля только в 2-х слоях. Различия растворимости образцов дентина в кислоте после обработки различными гелями для первого слоя можно рассчитать теоретически, так как для верхнего слоя имеются данные микрозондирования кальция. Уменьшение растворимости рассчитывалось следующим образом (таблица II): Для водяного контроля микрозонд показал содержание кальция на поверхности дентина 31,8 вес.%, а кислота растворяла из этой незащищенной поверхности 19,12 мкг Са. Отсюда следует, что для поверхности, обработанной гелем д-р Вильд, на которой микрозонд показал 15,8 вес.% кальция, при травлении должно было раствориться 9,51 мкг Са. Но в действительности растворилось только 5,46 мкг Са (= 57% от 9,51 мкг). Следовательно, растворимость в кислоте уменьшилась на 43%. Рассчитанные показатели для исследуемых гелей показаны на таблице II. Что касается этого уравнения, то можно возразить, что при предварительной обработке гелем на основе фторида олова кальций, в отличие от водяного контроля, уже был вымыт из поверхности дентина (ср. вес. % Са на поверхности дентина на рис. 3). В действительности первый деминерализованный слой водяного контроля по кальцию не идентичен первым деминерализованным слоям образцов, поскольку индикаторный ион (Са) частично замещен оловом. Но вышеупомянутая последовательность уменьшения растворимости после обработки указанными продуктами оставалась неизменной даже при расчетах без водяного контроля. В этом случае эффективное обызвествление (мкг Са) отдельных образцов выражается в процентах от показанного микрозондом содержания кальция на обработанных поверхностях. Например: эффективное обызвествление для геля на основе фторида олова (II) 0,99 мкг Са соответствует 14,9% от 6,7, что соответствует наибольшему уменьшению растворимости; эффективное обызвествление после обработки гелем фирмы д-р Вильд в 5,46 мкг Са соответствует 34,5% от 15,8, т.е. это следующий по величине уменьшения растворимости гель. Далее следуют гель на основе фторида олова (IV) – 38,9% и гель КАМ (63,9%). По уменьшению растворимости в кислоте новый гель фирмы д-р Вильд продемонстрировал явные преимущества перед американским стандартным продуктом гель КАМ. Результаты травления кислотой (рис. 1) показывают, что в необработанном гелем водяном контроле растворенные слои всегда содержали меньшее количество кальция. Этот феномен наблюдался во всех исследованиях в этой лаборатории с травлением дентина кислотой, о чем и было сообщено авторам. Насколько нам известно, причины этого постоянно повторяющегося явления никогда не исследовались. В специальной литературе хорошо описано распределение кальция в эмалевой оболочке коронки зуба, но не в дентине. Содержание олова в дентиновых поверхностях (в вес.%) после обработки различными гелями на основе фторида олова во всех случаях было значительно выше, чем после обработки водяными контролями. Содержание кальция было намного меньше, а содержание фосфора ненамного меньше, чем после обработки водными контролями. Это могло быть результатом отложений гидроксифосфата олова (Sn₂OHPO₄) и фторфосфата олова (Sn₃F₃PO₄). Отложение фторфосфата олова может быть, с одной стороны, причиной оказываемого кариостатического действия, образуя рН-регулируемое депо фторида, а, с другой стороны, причиной эффективного действия фторида олова на гиперчувствительность шейки зубов за счет механической закупорки канальцев. Кариостатическая активность SnF_2, в сочетании с антимикробным и противогингивитным действием, а также эффективное ослабление гиперчувствительности зубов, делают фторид олова практически универсальным местным терапевтическим средством гигиены рта для взрослых и пожилых людей (Рёлла и Эллинсен 1994).

Таблица 2. Расчет относительного уменьшения растворимости после 5 минут травления кислотой.

Литература

Аddy M, Mostafa P: Dentine hypersensitivity. I. Effects pro­duced by the uptake in vitro of metal ions, fluoride and for­maldehyde onto dentine. J Oral Rehab 15: 575-585 (1988)

Babcock F D, King J C, Jordan T H: The reaction of stan­nous fluoride and hydroxy apatite. J Dent Res 57: 933-938 (1978)

Boyd R L: Eighteen month evaluation of the effects of a 0,4% stannous fluoride gel on gingivitis in orthodontic patients. Am J Orthod Dentofacial Orthop 105; 35-41 (1994)

Donaldson J D: The chemistry of bivalent tin. Prog Inorg Chem8: 287-356(1967)

Dowell P, Addy M: Dentine hypersensitivity: A quantita­tive comparison of the uptake of metal salts and fluoride by dentine and hydroxyapatite. J Perio Res 19: 530-539 (1984)

Ellingsen J E: Scanning electron microscope and election microprobe study of reactions of stannous fluoride and stannous chloride with dental enamel. Scand J Dent Res 94: 299-305 (1986)

Ellingsen J E, Rolla G: Treatment of dentin with stannous fluoride: SEM and electron microprobe study. Scand J Dent Res 15: 281-286(1987)

Fischer C, Lussi A, Hotz P: Kariostatische Wirkungsme­chanismen der Fluoride. Eine Ubersicht, Schweiz Monatsschr Zahnmed 105: 311-317 (1995)

Gerrity D, Jordan T H: Reaction of SnF₂ with hydroxyapatite: Sn₂OHPO₄, Sn₃F₃PO₄, Ca(SnF₃)₂. J Dent Res 56 (Spec Iss B) B53, Abstr. 7 (1977)

Grobler S R, Senekal P J C, Laubscher J A: In vitro de-mineralization of enamel by orange juice, apple juice, Pepsi Cola and Diet Pepsi Cola. Clin Prev Dent 12 (5): 5-9(1990)

Jordan T H, Wei S H J, Bromberger S H, King J C: SnF₃, F₃PO₄: The product of the reaction between stannous fluoride and hydroxyapatite. Archs Oral Biol 16: 241-246 (1971)

Kambara W, Norde W: Influence of fluoride applications on some physicochemical surface properties of synthetic hydroxyapatite and human dental enamel and its conse­quences for protein adsorption. Caries Res 29: 210-217 (1995)

Lang N P: Epidemiology of periodontal disease. Arch Oral Biol 35:95-145 (1990)

Martell A E: Stability constants of metal-ion complexes. Special Publication No. 17, The Chemical Society,Lon­don, pp. 68, 193, 221 (1964)

Miller S, Truong T, Heu R, Stranick M, Bouchard D, Gaffar A: Recent advances in stannous fluoride techno­logy: antibacterial efficacy and mechanism of action to­wards hypersensitivity. Int Dent J 44: 83-98 (1994)

Muhler J C, Radike A W: Effect of a dentifrice containing stannous fluoride on dental caries in adults. II. Results at the end of two years of unsupervised use. JADA 58: 196-198 (1957)

Muhler J C: The effect of a modified stannous fluoride-cal­cium pyrophosphate dentifrice on dental caries in child­ren. J Dent Res 37: 448-450 (1958)

Ota K, Kikuchi S, Beierle J W: Stannous fluoride and its effects on oral microbial adhesive properties in vitro. Pediatr Dent 11: 21-25 (1989)

Purdell-Lewis D J, Arends J, Schuthof J A: SnF₂ treat­ment of enamel, hydroxyapatite or brushite at37 °C and 50 °C: an infrared investigation. J Biol Bucc 7: 179-190 (1979)

Rolla G, Ellingsen J E: Clinical effects and possible mechanisms of action of stannous fluoride. Int Dent J 44: 99-105 (1994)

Rolla G, OGaard B, De Almeida Cruz R: Fluoride-con­taining toothpastes, their clinical effect and mechanism of cariostatic action: a review. Int Dent J 41: 171-174 (1991)

Tinanoff N, Brady J M, Gross A: The effect of NaF and SnF₂ mouthrinses on bacterial colonization on tooth enamel: TEM and SEM studies. Caries Res 10: 415-426 (1976)

Tinanoff N, Manwell M A, Zameck R L, Grasso J E: Clin­ical and microbiological effects of daily brushing with either NaF or SnF₂ gels in subjects with fixed or remov­able dental prostheses. J Clin Periodontal 16: 284-290 (1989)

Tinanoff N: Progress regarding the use of stannous fluoride in clinical dentistry. J Clin Dent 6 (Spec Iss): 37-40 (1995)

Trash W J, Dodds M W J, Jones D L: The effect of stan­nous fluoride on dentinal hypersensitivity. Int Dent J 44: 107-118 (1994)

Wei S H J, Forbes W C: Reactions of powdered sound den­tin with several fluoride solutions. J Dent Res 48: 149-152(1969)

Механическое и химическое действие на дентин новой зубной пасты с фторидом олова

Томас Имфельд, Беатрис Зенер, Карола Куитц и Дуня Бродовски

Клиника профилактической стоматологии, пародонтологии и кариологии, Центр исследования зубов, ротовой полости и челюсти при Цюрихском университете

Резюме

Получила подтверждение эффективность местного применение фторида олова для профилактики кариеса и гингивита, а также для лечения гиперчувствительности зубов. Поскольку стабилизация фторида (II) олова в составе средств гигиены ротовой полости сопряжена с определенными фармакологическими сложностями, это соединение фтора не получило широкого распространения в массовом производстве. В Швейцарии была разработана новая зубная паста с фторидом олова (Эмолфтор/EmolfluorÒ), которая за счет применения специального стабилизатора, предотвращающего преобразование олова (II) в олово (IV), должна быть стабильной. В настоящем исследовании сравнивалась концентрация олова на поверхности дентина и его стойкость к действию кислоты после in-vitro нанесения различных препаратов с фторидом олова. Новая зубная паста с фторидом олова обеспечивала стойкость к кислоте, близкую к показателям стандартного геля с фторидом олова. Также in vitro исследовались чистящие, абразивные и шлифовальные возможности новой зубной пасты. Благодаря незначительной абразивной и шлифовальной способности и достаточной чистящей эффективности новая зубная паста с фторидом олова представляется подходящим средством гигиены рта для лиц с ретракцией десен и обнаженным дентином.

Acta Med Dent Helv 4: 107-114 (1999).

Ключевые слова: зубная паста, дентин, истирание, фторид олова, ослабление деминерализации

Принято к публикации: 11 марта 1999 года

Адрес для контактов:

Проф., д-р мед. Т. Имфельд, клиника профилактической стоматологии и оральной эпидемиологии, клиника профилактической стоматологии, пародонтологии и кариологии, Центр исследования зубов, ротовой полости и челюсти, Цюрихский университет, Платтенштрассе 11, 8028, Цюрих, Тел. 01/634 32 75, факс 01/634 43 08.

E-Mail: [email protected]

Предисловие

При любой механической очистке, в том числе и при гигиенических процедурах ротовой полости, возникает вопрос о возможных вредных побочных действиях используемого средства. Еще в 1844 году Годдард (1844) предупреждал, что слишком жесткие зубные щетки могут повреждать десну, а зубные пасты грубой консистенции способны обнажать шейку зуба и способствовать преждевременному его выпадению. Идеальная зубная паста должна сочетать максимальную чистящую и полирующую способность с минимальными показателями истирания и шлифования. Поскольку такой идеальной зубной пасты пока не существует, то стоматологи и дентальные гигиенисты должны знать о механических свойствах предлагаемых торговлей зубных паст, чтобы после по результатам оценки каждой из них они могли дать своим пациентам соответствующие консультации. Последнее исследование этих показателей представленных в торговой сети Швейцарии зубных паст было опубликовано в 1998 году (Имфельд и соавт. 1998). Абразивные способности паст определялись усовершенствованным в лаборатории авторов радиоизотопным методом по Грабенштеттеру и соавт. (1958). Шероховатость поверхности измерялась сканированием (Ашморе и соавт. 1972), а чистящая способность проверялась путем планиметрического исследования чистоты поверхности предварительно окрашенного дентина. Для наглядной демонстрации применения зубных паст в зависимости от проблем, пользователи зубными пастами (конечные потребители и пациенты) были разделены на 4 группы с различными требованиями и задачами в отношении чистки зубов. При оценке механического эффекта исследуемых зубных паст стало ясно, что кажущееся разнообразие рыночных предложений не так уж и велико. Если для лиц без ретракции десен, т.е. без обнажения шейки зубов (независимо от изменения окраски зубов) предлагается достаточный выбор подходящих зубных паст, то в отношении лиц с ретракцией десен, т.е. с оголенной шейкой зубов (независимо от изменения окраски) ситуация намного драматичнее. Особенно мала номенклатура зубных паст для лиц с ретракцией десен и с изменением окраски зубов, которые можно было считать соответствующими индивидуальным проблемам этих людей.

Действие лекарственных веществ, например, фторидов, в названной работе (Имфельд и соавт 1998) не исследовалось, что обусловило несколько однобокое изучение этой темы. Как известно, зубные пасты служат не только для очистки зуба, но и выполняют важную задачу носителя активных веществ, воздействующих на твердые и мягкие ткани.

Была подтверждена эффективность местного применения фторида олова для профилактики кариеса и гингивита, а также для лечения гиперчувствительности зубов. Фторид олова (SnF₂) является первым фторидным соединением, которое начали включать в состав зубных паст в США. Первые клинические исследования были опубликованы в 50-е годы (Мюллер и Радике 1957, Мюллер 1958). Несмотря на доказанное кариостатическое действие SnF₂, фармакологические трудности стабилизации олова в зубных пастах привели к применению других фторидных соединений, в частности, NaF, MFP и AmF. Благодаря успехам профилактической медицины и демографическим изменениям структуры населения все больше людей сохраняют зубы до глубокой старости. Преобладание гингивальной рецессии у взрослого и пожилого населения повышает риск корневого кариеса и гиперчувствительности шейки зубов. Эти условия требуют местных эффективных терапевтических средств, которые бы лечили кариес эмали и дентина, а также гингивиты и, кроме того, были способны ослаблять гиперчувствительность шейки зуба. По этой причине сегодня все большее внимание уделяется фториду олова (Имфельд и соавт. 1997). Основная трудность применения фторида олова в средствах гигиены ротовой полости в сложности стабилизации двухвалентного фторида олова (II) против гидролиза и окисления без снижения его биоусвояемости. Недавно исследовалось поглощение олова поверхностью дентина и растворимость в кислоте дентиновой поверхности после in vitro обработки гелем с фторидом олова (ЭМОФТОР/EMOFLUORÒ) (Имфельд и соавт. 1997). Исследуемый гель обеспечивал уменьшение растворимости дентина в кислоте, а выбранный для сравнения лидирующий гель с фторидом олова американского производства вообще не оказал защитного действия. Фирма-изготовитель также разработала зубную пасту с оловом (II), которая благодаря специальной стабилизации против преобразования олова (II) в олово (IV) должна сохранять стабильность на протяжении длительного срока хранения. Целевыми потребителями зубной пасты с оловом являются люди с открытым дентином и оголенной шейкой зуба в результате ретракции десны, поэтому эта паста должна характеризоваться малой абразивностью и, одновременно, достаточной чистящей способностью вследствие склонности дентина к изменению цвета. Целью настоящей работы было исследование поглощения фтора дентином человеческих зубов и повышения устойчивости дентина к кислоте после нанесения новой зубной пасты с фторидом олова, а также in vitro измерения шлифовальной, абразивной и чистящей способности пасты.

Материалы и методы

Определение растворимости в кислоте и поглощения олова

Исследуемые продукты: гель с фторидом олова (II), 1000 ч/млн F и 3123 ч/млн Sn, (положительный контроль), а также гель с фторидом олова (IV), 2000 ч/млн F  и 3123 ч/млн Sn, готовились непосредственно перед применением из соли фторида олова. Гель производства фирмы Д-р Вильд, партия № 891050 (EMOFLUORÒ), был обычным, купленным в аптеке гелем с SnF₂. Также применялись зубная паста фирмы Д-р Вильд, партия № 896052 (EMOFLUORÒ) и водяной контроль (отрицательный контроль).

Анализ исследуемых продуктов: перед проведением испытания в лаборатории измерялись рН, содержание F и Sn (II) в применяемых продуктах. Показатель рН определялся pH-метром Methrom-605 с электродом 6.0210.100 (Methrom AG, Херисау) по стандартной лабораторной методике (CIBA-GEIGY AG 1984). Содержание фторида измерялось аппаратом ORION 720-А с комбинированным фторидным электродом 9609BN (Orion-Europ, Кембридж, Великобритания) в соответствии с усовершенствованной в нашей лаборатории методикой Буше с соавт. (1971). Для измерения полного содержания фторида в ионизированной форме к применяемому ацетатному буферу добавляли 5 г/л комплексона 4 (EDTA), что обеспечивало комплексирование олова. Содержание олова измерялось в только что открытых тюбиках стандартизованным йодометрическим методом (Яндер и Яр 1989).

Дентиновый материал: для исследования брали 80 удаленных корней зубов человека (премоляры). Их поверхность очищали стоматологическим инструментом для снятия зубного камня (скалером) и до начала опыта хранили в 0,1% растворе тимола при температуре 4 °С. После этого образцы случайным образом  разделили на исследуемые группы (всего 50 корней): четыре группы по 10 корней, которые обрабатывались 4 испытываемыми продуктами, + одна группа водяного контроля для определения растворимости в кислоте. Группы по 6 корней (всего 30), которые обрабатывались испытываемыми продуктами или водяным контролем, служили для определения поглощения олова тканью зуба.

Обработка: Дентиновые образцы обрабатывались испытываемыми продуктами в течение 5 дней подряд  по 2 раза в день (всего 10 нанесений). Каждый образец сначала  15 секунд обрабатывали щеткой с1 г неразведенной зубной пасты. Затем для моделирования происходящего в условиях in vivo разбавления зубной пасты слюной, добавляли 3 мл заменителя слюны, и после снова обрабатывали щеткой 225 сек (общая длительность обработки щеткой 240 сек). В результате образовывалась взвесь зубной пасты (показатель рН взвеси продукта составлял примерно 5,5). С исследуемым гелем и водяным контролем поступали так же. После этого образцы  дентина в течение 10 сек промывали дистиллированной водой и затем 30 минут выдерживали под проточной (5 л/ч) деионизированной водой. Между сериями нанесений исследуемых продуктов образцы дентина хранились во влажностной камере.

Определение устойчивости к кислоте

Устойчивость к кислоте предварительно обработанных образцов дентина определялась с помощью кислотного травления (собственная модификация нашей лаборатории методики ГроблерА с соавт. 1990). Точно ограниченные круглые участки дентина (диаметром 5 мм) 5 минут протравливали 120 мкл молочной кислоты с рН=3. Этот процесс повторяли 6 раз для оценки 6 слоев. К собранным пипеткой после протравливания 120 мкл раствора добавляли 3,5 мл 0,75% хлорида стронция для маскирования фосфора, и доливали дистиллированную воду до 10 мл. Содержание кальция в этом растворе (полученном при протравливании дентина) измерялось атомно-абсорбционным спектрометром (Perkin Elmer 2380) на длине волны 422,7 нм. Результаты сообщались в мкг кальция в каждом слое и на поверхности образца (19,6 мм²).

Определение поглощения олова:

Поглощение олова после обработки исследуемыми продуктами определялось при помощи электронного микрозонда (система EDX, микроскоп с цифровым сканированием 962, Карл Цейс Швейцария АГ, Цюрих). Для этого образцы дентина предварительно в течение трех недель высушивались в эксикаторе с кизельгелем синим с последующим распылением углерода. Использовался комплект аппаратных средств в составе EDX Voyager IV, рабочая станция SunSрark 5, цифровой усилитель импульсов Pulstar, рабочая система Solaris-2x-UNIX и детектор Pioneer Novar-148c. Исследуемые поверхности были ровными, размером 50 х50 мкм, глубина проникновения электронов 15 мкм. Использовалась методика Filter-fit с корректировкой PROZA; напряжение усиливалось до 15 кВ. Техника измерения по описанию Ханише (1994). Содержание в весовых % рассчитывались стехиометрически. Результаты указывались в весовых % олова, кальция и фосфора на поверхности.

Статистика: Результаты сравнивались при помощи F-критерия Шеффе и PLSD Фишера. Этот вариационный анализ предусматривает сравнение исследуемых групп по принципу «все против всех». Он применяется для значений с нормальным распределением при сравнимом разбросе во всех сравниваемых группах.

Определение механического действия

Исследуемые продукты: стандартный абразив пирофосфат кальция и зубная паста фирмы д-р Вильд, партия № 896052 (EmofluorÒ).

Дентиновый материал: исследуемым материалом для определения чистящего действия и шероховатости поверхности после обработки исследуемой пастой, служили хранящиеся с 0,1% растворе тимола при 4 °С человеческие резцы, клыки и премоляры без кариеса и пломб. Корни (минимальная длина 10-13 мм, без выемок и неровностей) предварительно очищались скалерами, отделялись от коронарной части и в течение 2 минут полировались светло-голубыми (15 мкм) и светло-желтыми (3 мкм) дисками Sof-lex-Pop-on с водяным охлаждением под давлением нажима 30-40 г. В качестве образца для измерения относительной абразии дентина служили корни зубов крупного рогатого скота, которые предварительно обрабатывались как и человеческий дентин. Поскольку эта методика недавно была подробно описана Имфельд с соавт. (1998) мы укажем ниже лишь основное.

Определение относительной абразии дентина (RDA): по 8 корней зубов для исследуемой пасты и стандартного контроля подверглись радиоактивному облучению ³²Р и гамма-излучения. Затем корни закрепляли в акриле и в течение 25 минут обрабатывали щеткой на 8-щеточной машине, выполнившей в общей сложности 1500 горизонтальных возвратно-поступательных движений (60 в минуту) под нажимом 250 г (ручная зубная щетка Paro M39 medium, Esro AG). Использовалась суспензия (25 г зубной пасты, 40 мл заменителя слюны и 50 мкл противовспенивателя силикона) исследуемой пасты и стандартного абразива (10 г пирофосфата кальция, 50 г раствора карбоксиметилцеллюлозы (0,5%), глицерина (10%) и заменителя слюны, а также 50 мкл противовспенивателя силикона). Процесс обработки щеткой осуществлялся по так называемой «сендвич-технологии». Вначале выполнялся один проход со стандартной суспензией, затем с суспензией исследуемой пасты и после этого еще один проход со стандартной суспензией. После каждой обработки щетками пипеткой 3 раза отбирали по 0,5 г использованной взвеси и измеряли радиоактивность³²Р (PhosphorimagerÒ, Molecular Dynamics). По содержанию ³²Р в суспензии после обработки щеткой судили об абразии твердого вещества зуба. Для стандартной суспензии после каждого «сендвич»-прохода измеряли два значения, которые принимали за 100%. Относительная абразия дентина после обработки исследуемой пастой выражалась в % от этого стандартного значения.

Определение шероховатости поверхности (Ra) после обработки: 10 предварительно обработанных корней для исследуемой пасты и 10 корней для стандартного контроля вкладывали в прямоугольную емкость и обрабатывали на 6-щеточной машине перпендикулярно продольной оси корней (одно возвратно-поступательное движение в секунду, давление прижима250 г). Движение щеток машины воспроизводило горизонтальные движения щетки in vivo (щетки Paro M39 medium). Добавлялось по1 г суспензии зубной пасты или стандартной взвеси (приготовление аналогично испытанию RDA). Изменение шероховатости относительно первоначальной величины через 2, 5, 10 и 25 минут обработки щеткой определялось сканированием поверхности (Talysurf-50, Rank-Taylor-Hobson).

Определение чистящего действия (Re): Для изменения окраски поверхности (пятна) брали 10 корней для исследуемой пасты и 10 корней для стандартного контроля, и 17 часов перемешивали их в 5 мл раствора чая с рН 4 при 37 °С. Образцы с измененным цветом фотографировались и обрабатывались щеткой в горизонтальном направлении с1 г суспензии (исследуемая паста/стандарт, изготовление аналогично испытанию RDA) в течение 2, 5, 10 и 25 минут с прижимом250 г. Фотографии до и после обработки щеткой сравнивали планиметрической оценкой, и результат указывали как процентная доля поверхности без пятен от всей обработанной щеткой поверхности.

Результаты

Растворимость в кислоте и поглощение олова

Анализ  исследованных продуктов: Полученные значения приведены в таблице 1.

Растворимость в кислоте после обработки исследуемыми продуктами:

На рисунке 1 показана стойкость к кислоте образцов дентина после обработки исследуемыми продуктами, выраженная в показателях содержания кальция (мкг Са) в 6 протравленных слоях дентина. Достоверность различий растворимости в кислоте для каждого слоя после обработки теми или иными исследуемыми продуктами (или водой) устанавливалась с помощью критериев Фишера PLSD или F-критерия Шефе. БЮыли получены следующие результаты. Во всех шести исследованных слоях дентина была обнаружена одинаковая последовательность растворимости в кислоте для всех исследуемых продуктов. Минимальная растворимость наблюдалась для образцов дентина, обработанных гелем с фторидом олова (II), далее следовали образцы, обработанные гелем с фторидом олова (IV), образцы с гелем Emofluor, образцы  с зубной пастой Emofluor и водяной контроль. Ни для одного слоя не было обнаружено достоверных различий растворимости в кислоте после обработки гелем с Emofluor или зубной пастой Emofluor. Но обе группы образцов, обработанные Emofluor, во всех слоях демонстрировали достоверно более высокую устойчивость к кислоте, чем образцы, обработанные водяным контролем. Таким образом, новая зубная паста Emofluor снижает растворимость в кислоте практически так же, как и имеющийся в продаже гель Emofluor. Свежеприготовленные гели с оловом (II) и оловом (IV) в данном испытании были достоверно более эффективны, но вследствие нестабильной галеновой формы они не пригодны для длительного хранения и не годятся для индивидуальной гигиены ротовой полости.

Определение содержания олова, кальция и фосфора на поверхности дентина

Содержание олова на поверхности дентина после обработки различными исследуемыми продуктами (производилось по 2 измерения в каждой группе из 6 корней) показано на рисунке 2.

Все исследуемые продукты показали достоверные отличия (критерии Фишер PLSD или F-тест Шеффе) от водяного контроля. Содержание кальция на поверхности дентина после обработки различными гелями показано на рисунке 3. По содержанию кальция все исследуемые продукты показали достоверные отличия  от водяного контроля. Содержание фосфатов на поверхности дентина после обработки различными продуктами показано на рисунке 4. По содержанию фосфатов все исследуемые продукты показали достоверные отличия  от водяного контроля. Различий между гелем с оловом (II) и гелем с оловом (IV) обнаружено не было.

Таблица 1 Анализ исследованных продуктов.

* Свежеприготовленный препарат (3123 ч/млн Sn).

Рис. 1. Растворимость в кислоте после обработки исследуемыми продуктами и водяным контролем, выражаемая количеством растворенного кальция (мкг) в протравленных слоях 1-6.

Рис. 2. Содержание олова на поверхности дентина после обработки исследуемыми продуктами и водяным контролем.

Рис. 3. Содержание кальция на поверхности дентина после обработки исследуемыми продуктами и водяным контролем.

Механическое действие

Измеренные показатели сопоставлены в таблице II. Зубная паста Emofluor обладала достаточной чистящей способностью при незначительном шлифовании и абразии.

Таблица II. Относительная абразия (RDA), шлифование дентина (Ra) и очищающий эффект  (Re) исследуемой зубной пасты и стандартов (± стандартное отклонение) после 25 минутной чистки щеткой.

Обсуждение

Действие фторида олова

Уменьшение растворимости в кислоте является мерой воздействия фторида олова на дентин, которое требуется от продуктов с SnF₂. Реакция SnF₂ с дентином или гидроксилапатитом изучалась в различных исследованиях in vitro. Исследования под растровым электронным микроскопом показали, что в результате реакции SnF₂ с поверхностью дентина образуются отложения в дентинных канальцах (резюме ИМФЕЛЬД и соавт. 1997). Например, приведенные на рис. 5-8 снимки растрового электронного микроскопа показывают обширную закупорку дентинных каналов после нанесения свежеприготовленного SnF₂ (1000 ч/млн F, рН 3,6), которая отсутствует после обработки NaF (1000 ч/млн F, рН 3,9 и рН 7). Наряду с эффектом уменьшения гиперчувствительности шейки зуба подобная закупорка канальцев способствует увеличению стойкости к кислоте. Это, с одной стороны, оказывает профилактическое действие против корневого кариеса, а, с другой стороны, ослабляет разъедание поверхности и размягчение оголенной шейки зуба кислотами пищи. Таким образом, достигается другая важная цель лечения, а именно, замедляется развитие или прогрессирование клиновидных дефектов при механических воздействиях на уже поврежденную поверхность дентина средств гигиены полости рта (Давис и Винтер 1980, Мирау 1992). Изучение растворимости в кислоте после обработки различными исследуемыми продуктами показало, что свежий гель на основе олова (II) и олова (IV) обеспечивают наиболее эффективное уменьшение растворимости, далее следуют  гель и зубная паста Emofluor. Растворимость в кислоте после обработки гелем или зубной пастой Emofluor ни в одном из слоев не имела достоверных различий. Во всех случаях содержание олова на поверхности дентина (в весовых %) после обработки различными исследуемыми продуктами было достоверно выше, чем после обработки водяным контролем. Содержание кальция и фосфора было меньше (фосфора – в незначительной степени). Это может объясняться замещением кальция оловом (двух- или четырехвалентным) и отложением гидроксифосфата олова (Sn₂OHPO₄) и фторфосфата олова (Sn₃F₃PO₄). Отложение фторфосфата олова может быть, с одной стороны, причиной оказываемого кариостатического действия, образуя рН-регулируемое депо фторида, а, с другой стороны, причиной эффективного действия фторида олова на гиперчувствительность шейки зубов за счет механической закупорки канальцев. Согласно Рёлла и Эллингсен (1994) благодаря кариостатической активности, антимикробному действию, а также способности противодействовать гингивитам и снижать гиперчувствительность шейки зуба, фторид олова является идеальным местным терапевтическим средством гигиены ротовой полости для взрослых и пожилых пациентов с оголенными шейками зубов.

Рис. 4. Содержание фосфора на поверхности дентина после обработки исследуемыми продуктами и водяным контролем.

Механическое действие

Тот факт, что зубные пасты могут способствовать истиранию вещества зуба, известен давно. Этот эффект особенно важен при интенсивной гигиене рта. Используемые в этом исследовании машины чистили корни зубов горизонтальными возвратно–поступательными движениями. Такой способ, в общем, не рекомендуется, но обычно используется большинством потребителей (Мсдоннел и Домалакес 1952, Ругг-Гунн и соавт. 1979, Мирау и соавт. 1989). Как показал наш лабораторный опыт, при вертикальных или круговых движениях щетки воздействие на дентин проявляется не так быстро, но «табель о рангах» всех трех исследованных параметров этих продуктов оставалась без изменений. Отмечался значительный разброс результатов измерений Ra и Rе. Это обуславливалось различным качеством биологического материала (дентина) и возможно, различной «предысторией» корней зубов до их попадания в лабораторию. В данной работе истирание эмали не исследовалось. Если для чистки не применяются некоторые специальные пасты специализированного назначения, то при нормальной чистке зубной щеткой вопрос абразии эмали без значительных эрозивных дефектов не имеет существенной клинической важности.

Применение дентина (человека и крупного рогатого скота) в этом исследования объяснялось усиленной абразией дентина после ретракции десны и тем фактом, что исследуемые продукты с фторидом олова разработаны специально для пациентов с оголенным дентином. Химические, биологические, механические и физические сравнения показали, что дентин человека и крупного рогатого скота равноценны для исследований in vitro (Эссер и соавт. 1998). В настоящей работе дентин крупного рогатого скота использовался только для определения относительной абразии дентина. Проводимые в течение года в нашей лаборатории тесты со стандартом (пирофосфатом кальция) и стандартизованными пастами для проверки воспроизводимости результатов и валидации методов тестирования показывали одинаковые результаты RDA для человеческого и коровьего дентина, т.е. эти материалы взаимозаменяемы. Все тесты in vitro производились при нажиме250 г. Это воспроизводит условия обычного использования ручной зубной щетки и именно эта величина предписана международным стандартом измерения RDA. В появившейся недавно публикации о механическом действии зубных паст, реализуемых на швейцарском рынке (ИМФЕЛЬД и соавт. 1998), для упрощения оценки индивидуального применения исследуемых зубных паст отдельные тестируемые параметры разделялись на 4 или 5 групп, и затем выполнялась их относительная оценка. Для упрощения и наглядности возможного применения зубных паст пользователи (конечные потребители, пациенты) произвольным образом делились на 4 группы с различными приоритетами гигиены зубов. Исследуемая зубная паста Emofluor по показателям Ra и RDA была отнесена ко 2 группе (незначительное шлифование, малоабразивная), а по показателю Rе (33,3%) - к верхней области 3 группы (достаточная чистящая способность, т.е. Rе 20-40%). Таким образом, эта паста отвечает требованиям к механическим свойствам, которые выдвигаются к зубным пастам для лиц с ретракцией десны и с оголенной шейкой зубов. Такие пасты должны обеспечивать щадящую очистку оголенного дентина.

В отличие от геля с фторидом олова Emofluor, который применяется для интенсивной профилактики кариеса дентина и лечения гиперчувствительности шейки зубов и гингивитов путем втирания подушечкой пальца или зубной щеткой один раз в день, зубная паста Emofluor предназначена для обычной гигиены рта с использованием 3 раза в день после еды на обнаженных шейках зубов. Включенные в состав пасты поваренная соль и апельсиновое масло обеспечивают стимуляцию слюноотделения. Слабое вяжущее действие фторида олова компенсируется наличием в зубной пасте жидкого парафина. Поэтому исследуемая зубная паста пригодна для пожилых лиц, у которых кроме проблем с дентином обычно слабое слюноотделение.

Заключение

Недостаточное предложение на швейцарском рынке зубных паст, пригодных для потребительских групп 3 и 4 (лица с ретракцией десны без изменения или с изменением окраски эмали/дентина) (ИМФЕЛЬД и соавт. 1998) устранено за счет зубной пасты, специально разработанной для людей с проблемным дентином. Благодаря кариостатическому и антимикробному действию фторида олова, терапевтическому эффекту в отношении гингивитов и гиперчувствительности шейки зуба, а также щадящей абразивности и слабому шлифованию при достаточной чистящей способности, стабилизированная зубная паста Emofluor с фторидом олова вместе с гелем Emofluor расширяют ассортимент средств гигиены рта для проблемных групп потребителей и пациентов.

Литература

Ashmore H, Van Abbe N J, Wilson S J: The measurement in vitro of dentine abrasion by toothpaste, Br Dent J 133: 60-66 (1972).

Bushee E J, Grisson D K, Smith D R: An analysis of various flu­oride prophylaxis products for free fluoride ion concentra­tions. ASDC j Dent Child 38: 279-281 (1971)

CIBA-GEIGY AG; Laborpraxis 2. Messmethoden. 2. Aufl. Birk­hauser,Basel, pp. 54-72 (1984)

Davis W B, Winter P J: The effect of abrasion on enamel and dentine after exposure to dietary acid. Br Dent J 148: 253-256 (1980)

Esser M, Tinschert J, Marx R: Materialkennwerte der Zahn­hartsubstanz des Rindes im Vergleich zur humanen Zahn­hartsubstanz. Dtsch Zahnarztl Z 53: 713-717 (1998)

Goddard P B: The anatomy, physiology and pathology of the human teeth. Carey & Hart,Philadelphia, 133 (1844)

Grabenstetter J R, Broge R W, Jackson F L, Radike A W: The measurement of the abrasion of human teeth by dentifrice abrasives: A test utilizing radioactive teeth. J Dent Res 37: 1060-1068 (1958)

Grobler S R, Senekal P J C, Laubscher J A; In vitro demineralization of enamel by orange juice, apple juice, Pepsi Cola and Diet Pepsi Cola. Clin Prev Dent 12 (5): 5-9 (1990)

Hantsche H: Rontgenmikroanalyse mit dem Rasterelektro­nenmikroskop. In: Bartz W J (Ed): Praxis der Rasterelektronenmikroskopie und Mikrobereichsanalyse, Kontakt & Stu­dium Band 444. Expert, Renningen-Malmsheim, pp. 371-449 (1994)

Imfeld T, Sener B: Wirkung von Zinnfluorid-Gels auf Dentin. Zinnaufnahme und Saureloslichkeit von menschlichem Den­tin nach In-vitro-Behandlung mit verschiedenen Zinnfluo­rid-Gels. Acta Med Dent Helv 2:17-22 (1997)

Imfeld T, Sener B, Lutz F: Mechanische Wirkung von in der Schweiz marktfuhrenden Zahnpasten auf Dentin. Untersu­chung des Reinigungs-, Abrasions- und Anrauhungspoten-tials. Acta Med Dent Helv 3: 54-59 (1998)

Jander G, Jahr K F: Massanalysc. Theorie und Praxis der Titra­tionen mit chemischen und physikalischen Indikationen. 15. Aufl. Walterde Gruyter,Berlin, pp. 194-195 (1989)

McDonnell C H, Domalakes E F: Effects of toothbrushing with dentifrices containing chlorophyllin on gingivitis. J Periodontol 23: 219-228 (1952)

Mierau H-D: Der freiliegende Zahnhals. Dtsch Zahnarztl Z 47: 643-653 (1992)

Mierau H-D, Haubitz I, Volk W: Gewohnheitsmuster beim Ge­brauch der Handzahnburste. Dtsch Zahnarztl Z 44: 836-841 (1989)

Muhler J C, Radike A W: Effect of a dentifrice containing stan­nous fluoride on dental caries in adults. II. Results at the end of two years of unsupervised use. J Am Dent Assoc 58: 196-198 (1957)

Muhler J C: The effect of a modified stannous fluoride-calcium pyrophosphate dentifrice on dental caries in children. J Dent Res 37: 448-450 (1958)

Rolla G, Ellingsen J E: Clinical effects and possible mecha­nisms of action of stannous fluoride. Int Dent J 44: 99-105 (1994)

Rugg-Gunn A J, MacGregor ID M, Edgar W M, Ferguson M W: Toothbrushing behaviour in relation to plaque and gingivitis in adolescent schoolchildren. J Periodontal Res 14: 231-238 (1979).

Уменьшение зубного налета и ослабление воспаления после полосканий рта раствором масла чайного дерева 

Урих П. Заксер¹, А. Штойбле², С. Х. Жабо², Г. Мангини³

¹ Профилактический центр Цюриха, руководитель клиники

Внештатный преподаватель пародонтологии и профилактической стоматологии Цюрихского университета, Центр лечения заболеваний зубов, полости рта и челюсти

² Зубной гигиенист, Профилактический центр Цюриха

³ Станция эпидемиологии полости рта, клиника профилактической стоматологии, пародонтологии и кариологии, Центр лечения заболеваний зубов, полости рта и челюсти

Ключевые слова: жидкость для полоскания рта, химическая профилактика, масло чайного дерева

Адрес для корреспонденции:

Проф. д-р Урих П. Заксер

Профилактический центр Цюриха, руководитель клиники

Внештатный преподаватель пародонтологии и профилактической стоматологии Цюрихского университета, Центр лечения заболеваний зубов, полости рта и челюсти

Специалист-пародонтолог

ул. Герцогенмюлештрассе 14

СН-8051 Цюрих

Тел. +41 (0)1 325 15 05

Факс. +41 (0)1 325 15 02

E-Mail: u.p.saxer/[email protected]

         Масло чайного дерева (Melaleuca alternifolia) обладает антисептическим, фунгицидным и бактерицидным действием, которое доказано и для бактерий ротовой полости. Ксилитол известен как заменитель сахара и эффективен против Streptococci mutans и образования зубного налета. В настоящей работе исследовалась эффективность полосканий рта раствором, содержащим 1,5 % масла чайного дерева и 10% ксилитола (ТебодонтÒ, против образования зубного налета и воспаления сравнивался с полосканием плацебо).

Исследуемый раствор для полоскания рта значительно уменьшал воспаление после периода применения от 1 дня до 3 месяцев (на 26-32%). Более выраженное уменьшение воспалительного процесса наблюдалось в местах, недоступных для зубной щетки. При полоскании рта исследуемым раствором зубной налет уменьшался, а при полоскании плацебо он увеличивался на всех поверхностях. Отличие составляло 10-21%, но без статистической достоверности. Следовательно, полученные результаты дают основание утверждать о положительном действии полоскания рта исследуемым раствором как на воспаление, так и на образование зубного налета. Тенденция – однозначная. Статистическую достоверность отличий между группами можно было бы получить или при большем числе случаев (в данной работе лишь по 13 испытуемых в группе), или же при очень сильной эффективности исследуемого раствора для полоскания. Оба раствора для полоскания не вызывали нежелательных изменений в ротовой полости. Вкус раствора для полоскания через 3 недели оценивался как требующий улучшения, но через 3 месяца происходило привыкание, и замечаний было гораздо меньше.

1.   Введение

Сегодня общеизвестно, что зубная паста и щетка являются основным средством личной гигиены рта. Эффективность очистки зубов мало зависит от используемой зубной пасты. Однако выполненные в последние годы исследования различных зубных паст показали, что определенные активные вещества, добавляемые в зубные пасты, могут влиять на зубной налет и воспаление десен (Заксер 1997, 1998, Арвайлер и соавт. 2002). Но для более полного проявления действия на зубной налет и воспаление десны активные вещества должны применяться в форме раствора для полоскания. Во многих исследованиях предпринимались попытки оценить технику чистки зубов. При этом оказалось, что эффективность очистки больше зависела от человека, чем от применяемой техники. Важную роль играла продолжительность чистки зубов (Хубер и соавт., 1984), а также индивидуальное исполнение полученных инструкций и последующий контроль (Главинд, 1990). По этой причине в нашем исследовании не уделялось внимание технике чистки зубов, и соответствующий инструктаж не проводился. За первые 3-12 недель участия в исследовании у всех пациентов улучшилась ситуация с гигиеной рта.

Химическое действие отдельных веществ в полости рта известно, и потенциальные взаимодействия между отдельными компонентами труднопредсказуемы (Адди и соавт. 1990).

В одном 6-недельном исследовании было показано, что зубная паста на растительной основе обеспечивает достоверно более эффективный контроль гингивитов и зубного налета, чем традиционные зубные пасты с фтором (Янкель и соавт. 1993, Заксер и соавт. 1997). По результатам 6-месячного (Сватун и соавт. 1989 и 1993, Оверхользер и соавт. 1990) и 3-летнего исследования (Линдне и соавт. 1998, Эльвуд и соавт. 1998) была признана эффективность подавления воспаления другими зубными пастами и растворами для полоскания рта. Почти независимо от продолжительности наблюдения, зубные пасты с определенными химическими профилактическими компонентами снижали зубной налет на 30% и ослабляли гингивиты на 25% (Арвайлер и соавт. 2002).

Масло чайного дерева с давних пор считается «универсальным лечебным средством». Это дерево произрастает на юго-востоке Австралии и местным жителям хорошо известно лекарственное действие его масла. «Цюрихский» врач, лечащий природными средствами, Заллер вместе с Райхлингом описали историю масла и некоторые его компоненты (Заллер и Райхлинг 1995). Это примерно 100 компонентов, из которых наиболее известными являются терпинолен, лимонен, цинеол (эвкалиптовое масло). Эти эфирные вещества обладают антисептическим, фунгицидным и бактерицидным действием (Райхлинг и соавт. 2001), которое недавно было подтверждено и в отношении перпероральных бактерий в работе КуликА с соавт. (2000). Минимальная подавляющая концентрация (МПК) и бактерицидная концентрация (МБК) для различных пероральных бактерий определялись при сравнении с хлоргексидином. При этом наиболее восприимчивыми бактериями оказались Actinobacillus actinomycetemcomitans (ААС), P. gingivalis и Prevotella intermedia. Таким образом, продукты с маслом чайного дерева могут быть эффективны и против воспаления десен. Эффективная антибактериальная концентрация in vitro колебалась в пределах 0,05 – 3,3%, причем такая концентрация растительного экстракта допускает применение в ротовой полости, поскольку не вызывает каких-либо побочных действий. Правда, Фритц (2000) пишет об участившихся случаях контактной аллергии после широкого применения этого масла. Но это действие в основном связывают с некоторыми устаревшими экстрактами, например, с терпиноленом и аскаридиолом. Цинеол, похоже, не подтвердил способность вызывать сенсибилизацию, предполагавшуюся ранее. Недавно Арвайлер и соавт. (2000) проверяли влияние масла чайного дерева (ф-ма Максим, Кельн) с молоком в качестве эмульгатора на отложения зубного налета и жизнеспособность бактерий, но не обнаружили какого-либо эффекта.

Ксилитол является заменителем сахара и поглотителем влаги. Ксилитол во всем мире применяется в косметической и фармацевтической промышленности. Различные исследования in vitro показали, что ксилитол оказывает подавляющее действие на рост пероральных бактерий, в частности, Streptococcus mutans. В 3-месячном исследовании у 76 испытуемых, пользовавшихся зубными пастами с ксилитолом и глицерином (9,9 + 20%) или сорбитом (28%) было установлено достоверное уменьшение S. mutans в слюне группы ксилитол + глицерин (Сванберг и Биркед, 1991). В другом 6-месячном двойном слепом исследовании добавление 10% ксилитола в зубную пасту с активным веществом триклозан было связано с достоверным уменьшением S. Mutans и зубного налета более, чем у 150 испытуемых (Янессон и соавт. 2002).

Достаточно давно в продаже предлагается гель с экстрактом масла чайного дерева (ТебодонтÒ), который также испытывался in vitro (Кулик и соавт. 2000). Экстракты этого геля соединяли с 10% ксилитола в составе раствора для полоскания рта и сравнивали действие на пациентов.

Целью данной работы было исследование раствора для полоскания рта по следующим пунктам:

1. Насколько он подавляет образование зубного налета при обычном полоскании рта конечным потребителем?
2. Существует ли связь между протеканием процесса воспаления десен у испытуемых или образованием зубного налета и используемым раствором для полоскания рта.

2. Материалы и методы

2.1. Исследуемый раствор

1. Исследуемый раствор для полоскания рта (ТебодонтÒ) содержащий: масло чайного дерева (1,5%), ксилитол (10%), сорбит, глицерин, пропилен гликоль, воду, гидрогенизированое касторовое масло PEG-40, сахарин натрия, ароматизатор
2. Раствор для полоскания плацебо содержащий: сорбит, глицерин, воду, гидрогенизированое касторовое масло PEG-40, сахарин натрия, ароматизатор*

2.2. Испытуемые

Из группы в составе 112 пациентов, изъявивших желание участвовать в исследовании, было отобрано 30 испытуемых.

Испытуемые пришли по объявлению в газете о проверке действия раствора для полоскания рта против воспаления десен. Для участия в исследовании отбирались люди в возрасте от 18 до 65 лет, имевшие не менее 20 собственных зубов, причем под коронками допускалось не больше 4-х зубов (по 1 в каждом квадранте). Испытуемые получили устную и письменную информацию о целях исследования и дали письменное согласие на участие в нем. Все испытуемые, в общем, находились в хорошей физической форме. Пациенты с медицинскими рисками и курящие исключались.

Зондирование не должно было обнаруживать дефектов глубиной более5 мм. Кроме выраженного воспаления десен (индекс кровоточивости в среднем >1,5 SBI в первом и третьем квадрантах, 4 участка на 1 зуб) стоматологическое состояние испытуемых было хорошим.

Пациенты должны были чистить зубы не менее 2-х раз в день. Требования к технике чистки зубов не выдвигались. В течение исследования пациенты не должны были пользоваться средствами очистки межзубных промежутков. Никакие дополнительные меры по улучшению гигиены рта пациентов не предпринимались. Единственным выдвигаемым требованием было не менее 30–60 секунд полоскать рот 10 мл раствора 3 раза в день через 30 минут после чистки зубов. Кроме того, пациенты должны были пользоваться только выданными им щетками Эмоформ Сенситив и зубной пастой Колгейт Гель, и не пользоваться другими средствами полоскания рта.

После обследования испытуемым выполняли удаление зубного налета и отложений зубного камня. После регистрации полученных при предварительном обследовании данных о воспалении, испытуемые случайным образом были разделены на группы. Всем испытуемым выдавалась зубная щетка (Эмоформ Сенситив) и одинаковые зубные пасты (Колгейт Гель), которыми нужно было пользовать в предварительный период (до начала) исследования. Через 3-6 недель после отбора и инструктажа собирались начальные подробные данные (начальное обследование) и после этого раздавались исследуемые или контрольные растворы для полоскания рта. Испытуемым выдавались новые зубные щетки Эмоформ Сенситив и зубные пасты Колгейт Гель. Всем испытуемым выполнялась профессиональная очистка зубов. Эффективность удаления зубного налета проверялась окрашиванием.

2.3. Организация исследования

По возрасту, полу и индексу воспаления (SBI) испытуемые случайным образом были разделены на 2 группы. Выдача растворов для полоскания рта производилась в начале каждого периода исследования. Исследователи и пациенты не знали, какой раствор для полоскания они получали. После этого на протяжении 12 недель испытуемые должны были пользоваться выданным им раствором для полоскания.

 2.4.Диагностика

В начале исследования, через 3 и 12 недель определялись следующие параметры (в указанной последовательности):

1. Оценка безопасности;
2. Язык, твердое и мягкое небо, переходные складки, буккальные поверхности щек, губ и основание языка на каждом этапе исследований проверялись по 3 степеням изменений;
3. Индекс кровоточивости десневой борозды (Мюлеманн и Зон, 1971);
4. Кровоточивость десневой борозды измерялась в двух квадрантах (верхняя челюсть справа и нижняя челюсть слева ) в 4-х местах для каждого зуба (дистобуккально, буккально, мезиобуккально и перорально);
5. Индекс зубного налета;
6. Состояние зубного налета определялось после окрашивания зубов по индексу Турески в тех же квадрантах для 6 поверхностей каждого зуба.
7. Выполнялись полустандартизованные фотоснимки в области боковых зубов справа от 3± до 5± при сомкнутых зубных рядах.
8. Через 3 недели и в конце исследования пациенты заполняли анкету, в которой нужно было дать субъективную оценку возникших изменений.
9. По окончании 12-недельного периода исследования пациентам выполнялась бесплатная очистка зубов.

Статистическая обработка данных выполнялась на станции пероральной эпидемиологии Цюрихского университета. Клинические данные собирались собственной программой (на базе Hypercard) и проверялись на достоверность уже при вводе в центральный компьютер. Обработка данных (сведение и сортировка) осуществлялась при помощи MicrosoftÒ Exel: mac 2001. Данные оценивались статистической программой StatView (4,51). Различия между последовательными данными (лонгитудные) проверялись на статистическую достоверность при помощи парного t-критерия. Различия между исследуемой и контрольной группами проверялись на статистическую достоверность непарным t-критерием.

3. Результаты

Результаты представлены в таблицах I-IV и на рисунках 1-2.

Вначале в исследуемую группу было отобрано 30 испытуемых из 112 желающих. Еще до начала исследования 3 испытуемых выбыли. После 1 обследования один испытуемый из тестируемой группы не явился на следующее обследование. На момент предварительного отбора между обеими группами отсутствовали достоверные различия по возрасту, полу и индексу SBI. В исследуемой группе SBI составлял 2,06, а в группе плацебо 1,92.

Таблица I. Средний суммарный индекс кровоточивости десневой борозды (SBI) (х) и стандартное отклонение (s) в группах испытуемых на момент обследований.

Изменения в отдельных группах между начальными и конечными данными недостоверны (t-критерий для парных значений р=0,002 для исследуемого средства и 0,003 для плацебо).

Таблица II. Среднее воспаление (SBI) (х) и стандартное отклонение (s) у испытуемых на мезиальной поверхности при трех обследованиях.

Таблица III. Суммарный средний индекс образования зубного налета (по Турески) (х) и стандартное отклонение (s) в двух группах испытуемых при трех обследованиях.

* Отличие между группами недостоверно. Явная тенденция (t-критерий: р=0,06).

Таблица IV . Оценка качества чистки зубов (если отдельно не оговорено иное, очень хорошо = 3 пункта, хорошо = 2 и наличие нарушений 1 пункт. Чем больше значение среднего для всех опрошенных показателя, тем более эффективно действие полоскания рта).

             Начало           Через 3 недели      Через 3 месяца

Рис. 1. Общий индекс кровоточивости десневой борозды (SBI) и разброс показаны ящичковой диаграммой по группам испытуемых и по отдельным обследованиям (серым цветом обозначено полоскание рта исследуемым раствором).

            Начало   Через 3 нед. Через 3 мес. Начало   Через 3 нед. Через 3 мес.

Рис. 2. Индекс образования зубного налета дистально (Турески) и разброс показаны ящичковой диаграммой по группам испытуемых и по отдельным обследованиям (серым цветом обозначено полоскание рта исследуемым раствором).

Безопасность

У большей части испытуемых отсутствовали изменения слизистой оболочки. Было зарегистрировано 29 случаев незначительных изменений в исследуемой группе и 31 случай в группе плацебо, но эти изменения нельзя было связать с исследуемым продуктом. У всех испытуемых полоскание не вызывало изменений слизистой оболочки.

Воспаление

В таблице I показаны оценки воспалений. В тестовой группе индекс SBI вначале составлял 2,69, а в контрольной группе 2,17. Эта разница не была спастически достоверной, как это видно и на рис. 1. Через 3 недели индекс незначительно, а через 3 месяца существенно снизился (р<0,01), но без достоверности отличия.

Уменьшение SBI в группе использования тестового раствора для полоскания рта составило 0,76, а в группе плацебо - 0,53 пункта. В таблице II показаны изменения SBI на мезиальных поверхностях. Здесь уменьшения составили соответственно 0,84 и 0,55. На рисунке 1 хорошо видно, что, во-первых, воспаление уменьшилось в группе применения тестового раствора для полоскания рта, а, во-вторых, что полоскание рта во всех случаях было эффективно, поэтому разброс отдельных значений в конце был незначительным.

Отложение зубного налета и индекс зубного налета

В таблице III и на рисунке 2 показаны полученные значения индекса зубного налета. Вначале индекс зубного налета в тестовой группе составлял 2,68 и в группе плацебо 2,52. Через 3 недели индекс в тестовой группе незначительно снизился (2,56), а в группе плацебо повысился до 2,67. В конце периода наблюдения индекс в тестовой группе еще больше снизился (2,43), а в группе плацебо остался без изменений (2,67). В отношении образования зубного налета на других поверхностях были сделаны аналогичные наблюдения, причем в обеих группах налеты на буккальных поверхностях увеличились.

В таблице IV показаны ответы испытуемых на вопросы. При этом обращает на себя внимание, что оба раствора были приняты благожелательно, хотя и были жалобы на неприятный вкус исследуемого раствора, особенно в первые 3 недели.

4. Обсуждение

Полоскания как по индексу кровоточивости десневой борозды, так и по индексу зубного налета показали  хорошо интерпретируемые результаты, но без достоверных различий между обоими растворами. На момент скринингового обследования индексы кровоточивости десневой борозды в обеих группах были сравнимыми, а через 3-6 недель было определенное различие, но не достоверное. В группе плацебо индекс кровоточивости десневой борозды изначально был меньше. Различия могли быть связаны с удалением зубного камня перед началом исследования. У некоторых пациентов имело место значительное воспаление, что следует из разбросов и ящичковой диаграммы. Различия сравнивались между собой статистическими методами, поэтому исходная ситуация не влияла на результат. SBI явно снижался при использовании обоих растворов, - как в начальный момент, так и через 3 месяца. В группе использования тестового раствора снижение было большим (28%), чем в контрольной группе (24%). Профессиональное удаление зубного камня привело к 10% или 6% уменьшению в первый 3-недельный период, но уменьшение на 28% или 24% через 3 месяца объяснялись исключительно полосканиями.

В других сравнимых исследованиях, например Линде с соавт. (1993), через 6 месяцев в тестовой группе отмечалось уменьшение воспаления с 1,5 до 1,3, тогда как в контрольной группе показатели оставались неименными. При количестве испытуемых более 100 это различие является достоверным, хотя гингивит уменьшился лишь на 20%.

Более выраженное уменьшение воспаления было выявлено на буккальных поверхностях, причем индекс зубного налета именно на этих поверхностях до этого был увеличен. Правда, нужно отметить достаточно низкий индекс (1,7-1,8) на этих доступных для зубной щетки поверхностях. Динамика индекса зубного налета (таблица III) в тестовой группе показывает незначительное его уменьшение с 2,7 до 2,4 (-9%), а в группе плацебо повышение с 2,5 до 2,7 (+6%). Однако при таком небольшом числе участников, как в этом исследовании, это отличие не достоверно (р=0,06%). На дистальной поверхности зубов разница между исследуемым раствором и плацебо составляла 20% (как это следует из рисунка 2), и средние значения ящичковой диаграммы в исследуемой группе при каждом следующем обследовании уменьшались, а в группе плацебо – увеличивались.

В общем, в таких исследованиях всегда отмечается улучшение исследуемых параметров, что объясняется т.н. «эффектом участия». Но воздействие на все зубные поверхности, в том числе и недоступные для зубной щетки, дает клиническое подтверждение терапевтического эффекта полоскания рта исследуемым раствором. Данных на рис. 2 показывают эту выраженную тенденцию, которая должна стать еще большей при увеличении длительности исследования или количества участников. Очевидно, что у испытуемых сложилось мнение, что они получают сильнодействующее средство, способное устранить зубной налет и воспаление. Этот эффект наиболее четко отмечался в контрольной группе, у участников которой зубной налет на всех поверхностях увеличился. Разница между обеими группами по индексу зубного налета ни в одном сравнении не была существенной. Интересно отметить тенденцию увеличения зубного налета, что, в принципе, должно было повлечь усиление воспалений десен. Но в обеих группах воспаление уменьшилось, что нельзя приписать только мотивационному эффекту, так в группе плацебо отложение зубного налета увеличилось.

Из анкет следует, что по неприятному вкусу испытуемые могли отличить раствор с активными веществами. Характерно, что все испытуемые достаточно благожелательно отнеслись к исследуемому раствору через 3 недели применения, и еще лучше – через 3 месяца. На легкость распознавания активного вещества указывает тот факт, что вначале испытуемые, получавшие раствор с активным веществом, из-за неприятного вкуса не могли набрать в рот оговоренные 10 мл раствора.

5. Выводы

         Это исследование in vivo показало, что 3 месяца полоскания рта исследуемым раствором (ТебодонтÒ) с 1,5% масла чайного дерева и 10% ксилитола, несмотря на небольшое количество испытуемых (по 13 в группе) значительно ослабило воспаление и незначительно уменьшило образование зубного налета. Полоскание рта исследуемым раствором не вызывало изменений в ротовой полости. В первые 3 недели испытуемые отмечали необходимость улучшения вкуса жидкости для полоскания, но после 3 месяцев применения наступило привыкание.

Таким образом, благодаря доказанной здесь эффективности указанный раствор для полоскания рта является растительной альтернативой для профилактики ротовой полости и лечения воспалений слизистой оболочки рта, гингивитов, а также для пациентов с интенсивным отложением зубного налета. Благодаря хорошей переносимости слизистой оболочкой средство пригодно и для длительного применения.

Литература

Addy M, Jenkins S, Newcombe R: The effect of triclosan, stan­nous fluoride and Chlorhexidine product on plaque regrowth over a 4-day period. J Clin periodontal 17: 693-697,1990

Akweiler N, Netuschil L, Sculean A, Reich E: Naturliche anti­bakterielle Wirkstoffe am Beispiel von Teebaumol. Quintes­senz, 51; 495-500, 2000

Auweiler B N, Hellwig E, Auschill T M: Antibakterielle Lang­zeitwirkung einer zinkchlorid- und einer triclosanhaltigen Zahnpaste. Prophylaxe Impuls 6:117-122, 2002

Axelsson P & Lind he J: Effect of controlled oral hygiene proce­dures on caries and periodontal disease in adults. J Clin Peri-odontol 5:133-151,1978

Curilovic Z, Axelsson P: SBI versus Gl - eine klinische Studie. Schweiz. Mschr Zahnmed 90: 36S-73,1980

Ellwood R P, Worihingoton H V, Blinkhorn A S B, Volpe A R, Davtes R M; Effect of a triclosan/copolymer dentifrice on the incidence of periodontal attachment loss in adolescents. J Clin Periodontol 25: 363-367, 1998

Fritz T M: Teebaumцl-Kontaktallergien. Hautnah 3:19-22,2000

Galle-Hoffmann U, Konig WA: Teebaumol, 1-3 Folge, Dtsch. Apoth. Zeitung 139: 294-302,1999; (Nr 3), N3 50; 53-62,1999

Glavind L: Means and methods in oral hygiene instruction of adults. Tandlaegebladet 94: (6) 217-246,1990

Huber B, Rueger R & Hefe A: Der Einfluss der Zahnreinigungsdauer auf die Plaquereduktion. Schweiz Mschr Zahnmed 95: 985-992,1985

Jannesson L, Renvert S, Kjellsdotter P, Gaffar A, Nabi N, Birkhed D: Effect of a Tridosan-Containing Toothpaste Sup­plemented with 10% Xylitol on Mutans Streptococci in Saliva and Dental Plaque. Caries Res. 36: 36-39, 2002

Kulik E, Lenkheit K, Meyer J; Antimicrobial effects of a tree oil (Melaleuce alternifolia) on oral microorganisms. Acta med dent helv. 5:125-130,2000

Loe H, Theilade E, Jensen S B: Experimental gingivitis in man. J Periodontol 36; 177-187,1965

Lindhe J, Rosling B, Socransky S S, Volpe A R: The effect of a triclosan containing dentifrice on established plaque and gin­givitis. J Clin Periodontol 20: 327-334,1993

Mьhlemann H R & Son s: Gingival sulcus bleeding. A leading symptom in initial gingivitis. Helv Odont Acta 15; 107,1971

Overholser D C, Meiller T F, DePaola L G, Minah G E, Nieuhaus C: Coparative effects of 2 chemotherapeutic mouthrinses on the development of supragingival dental plaque and gingivi­tis. J Clin Periodontol. 17: 575-5 79,1990

Pfister G: Atherische Ole im Blickpunkt dokumentierter therapeu­tischer Anwendung. Schweizer Apotherkerzeitung 7:247-250, 1998

Ramberg P, Axelsson P, Lindhe J: Plaque formation at healthy and inflammed gingival sites in young individuals. J Clin Peri­odontol 22(1): 85-88,1995

Reichling J, Harkenthal M, Saller R: Australisches Teebaumцl. Schweiz. Zschr Ganzheits Medizin, 13: 50-39,2001

Rosling B, Dahlen G, Volpe A, Furuichi Y, Ramberg P, Lindhe J: Effect of triclosan on the subgingival microbiota of periodon­titis-susceptible subjects. Journal of Clinical Periodontology 24: 881-887,1997

Saller R, Reichling J: Teebaum-Ol. Deutsche Apotheker Zei­tung, 135: 40-48,1995

Saxer U P, Menghini G, Bonert K J & Ley F: The effect of Parodontax toothpaste on plaque and gingival bleeding, J. Clin Dent. 6:154-156,1995

Saxer U P; Zahnpasten Teil 2, Gingivitis, Glanz der Zдhne, Zahn­halsempfindlichkeit, Prophylaxe Impuls II (1): 6-15,1998a

Saxer u P: Zahnpasten Teil 1: Zusammensetzung und Wirkung auf Karies. Prophylaxe Impuls I. (4): 162-169,1997b

Svatun B, Saxton C A, Huntington E, Cummins D: The effects of three silica dentifrices containing Triclosan on supragingi­val plaque and calculus formation and on gingivitis. Int Dent J 43: 441-52,1993.

Svatun B, Saxton C A, Rolla G van der Ouderaa F: A 1-year study on the maintenance of gingival health by a dentifrice containing a zinc salt and non-anionic antimicrobial agent. J Clin periodontol. 16: 75-80,1989

Svanberg M & Birkhed D: Effect of dentifries containing either xylitol and glycerol or sorbitol on mutans streptococci in sali­va. Caries Res. 25: 449-453,1991

Walsh L J, Longstaff J: The antimicrobial effects of an essential oil on selected oral pathogens, Periodontology 8:11-15,1987

Turesky S, Gilmore N D, Glickman I: Reduced plaque forma­tion by the chloromethyl analogue of Vitamin C. J Periodontol. 41: 41-43,1970

Yankell S L, Emling R C, Perez B: Six month evaluation of Parodontax dentifrice compared to a placebo dentifrice. J Clin Dent 4; 26-30,1993